賈騏駿

摘要[目的]探討過氧化氫酶（CAT2）在擬南芥根部響應(yīng)鎘脅迫過程中對主根生長、活性氧積累以及生長素信號的影響。[方法]在1/2 MS固體培養(yǎng)基中加入不同濃度的鎘處理擬南芥Col-0和CAT功能缺失突變體cat2幼苗。[結(jié)果]研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫會抑制主根的根長，而cat2的根長的抑制率與Col-0并無明顯差異。鎘處理后Col-0和cat2根中CAT活性也不會發(fā)生顯著變化。進一步比較Col-0和cat2根在鎘脅迫下的活性氧的積累，兩者活性氧增長率大致相同。最后檢測DR5：：N7-VENUS和cat2 DR5：：N7-VENUS根中生長素的信號表達，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫對Col-0和cat2根中生長素的抑制率也沒有差異。[結(jié)論]CAT2不參與調(diào)控擬南芥根部對鎘脅迫的耐受性。

關(guān)鍵詞 擬南芥；鎘脅迫；過氧化氫酶；活性氧；生長素

中圖分類號 Q945.78 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0001-04

Abstract[Objective]Impact of catalase was discussed in the article based on the result of primary root length， reactive oxygen species accumulation and auxin signal in the primary root of Arabidopsis thliana responsive experiment under cadmium stress.[Method]Different concentrations of cadmium were added to 1/2 MS solid medium to treat Arabidopsis Col0 and CAT2 lossoffunction mutant cat2 seedlings.[Result]The study found that cadmium stress inhibited the root length of the main root， but the inhibition rate of cat2 root length was not significantly different from that of Col0.However， the root length results between cat2 and Col0 were no obvious differences. A similar conclusion also could be derived from the CAT activity in primary root after the cadmium stress treatment. Further comparing the accumulation of active oxygen in the roots of Col0 and cat2 under the cadmium stress， the growth rate of their active oxygen is roughly the same. Finally， the signal expression of auxin in Col0 DR5：：N7VENUS and cat2 DR5：：N7VENUS roots was detected. It was found that there was no difference in the inhibition rate of auxin in Col0 and cat2 roots by cadmium stress.[Conclusion]CAT2 is not involved in the regulation of tolerance to cadmium stress in Arabidopsis roots.

Key words Arabidopsis thaliana；Cadmium stress；Catalase； Reactive oxygen；Auxin

近些年，重金屬污染已經(jīng)威脅到工農(nóng)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，嚴重影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟損失。其中，高毒性、高水溶性的鎘（Cd）容易被植物吸收在體內(nèi)富集，影響植物正常的生長發(fā)育和新陳代謝，最終造成植物死亡[1]。而這些被鎘污染的植物通過食物鏈進入人體后，積累到一定劑量會引起急性或慢性中毒，損害肝臟、腎臟、骨骼，甚至引發(fā)癌癥[2]。

Cd脅迫抑制植物根系發(fā)育，龐大的根系不僅能夠支持固定整個植株，而且不斷地從土壤中吸收植物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足地上植物組織生長、發(fā)育、代謝需求[3-7]，當植物受到土壤中鎘脅迫后，根作為第一道防線直接參與植物對脅迫的應(yīng)激響應(yīng)；Cd脅迫誘導(dǎo)活性氧（ROS）的積累，破壞生物大分子及細胞的完整性，影響植物生長必需元素（Fe、Ca、 Mg、P 和 K）和水分的吸收、運輸及抗氧化酶的活性，從而抑制植物生長發(fā)育[8-9]；Cd脅迫會抑制植物體內(nèi)生長素表達分布，有研究表明，當植物受到Cd脅迫后，植物體內(nèi)的生長素的合成和極性運輸被抑制，主根長度變短，側(cè)根數(shù)量減少，植物可以動態(tài)和差異性的調(diào)節(jié)生長素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使植物在逆境下更好地適應(yīng)和生存[10-11]。

植物在受到Cd脅迫后會激活多種響應(yīng)途徑來抵抗或減弱脅迫程度。植物首先會限制Cd的吸收與運輸，將大部分吸收的Cd儲存在根部液泡中，減少Cd由根系向地上部的轉(zhuǎn)運[12-13]；然后植物螯合素與Cd結(jié)合，降低細胞內(nèi)游離的Cd2+，減輕對植物的毒害[14]；Cd脅迫誘導(dǎo)ROS在植物體內(nèi)大量積累，這些ROS隨后被超氧化物氣化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸氧化酶（APX）、谷胱甘肽（GSH）等構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)所清除進而避免植物受到氧化脅迫[15-18]。

CAT是ROS清除體系的重要組成部分，主要負責(zé)清除H2O2 [19]。Cd脅迫能夠不同程度地改變植物體內(nèi)抗氧化酶的活性，表明包括CAT在內(nèi)的抗氧化酶參與植物對Cd脅迫的響應(yīng)[20]。CAT是否參與擬南芥根對Cd脅迫的耐受性響應(yīng)并沒有被明確報道，擬南芥中已經(jīng)報道的共有3個CAT基因，其中CAT2是植物CAT的主要形式。因此，借助CAT2缺失突變體cat2，以期探究CAT2是否參與到植物根部對Cd脅迫的調(diào)控響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。擬南芥（Arabidopsis thliana）哥倫比亞野生型（Col-0）、T-DNA插入突變體cat2（SALK_057998）、轉(zhuǎn)基因材料DR5：：N7-VENUS、cat2 DR5：：N7-VENUS。

1.1.2

主要試劑。MS，KH2PO4，K2HPO4，蔗糖，2-嗎啉乙磺酸，瓊脂粉，氯化鎘（CdCl2），聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），抗壞血酸（ASC），DCFH-DA熒光染料，無水乙醇，次氯酸鈉。

1.1.3

主要儀器。垂直培養(yǎng)板，滅菌鍋，激光共聚焦顯微鏡LSM710，掃描儀，超凈工作臺，冰箱，pH計，紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1

擬南芥種子消毒。取少量擬南芥種子于離心管中，超凈工作臺內(nèi)加入70%乙醇浸泡5 min，棄上清；向離心管中加入25%次氯酸鈉，振蕩后靜置15 min，棄掉上清；向離心管中加入1 mL無菌ddH2O振蕩棄掉上清，重復(fù)6～8遍；用無菌槍頭將種子均勻地點到1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)板上，晾干后用透氣膠帶封口，4 ℃冰箱內(nèi)低溫春化3 d后將培養(yǎng)板放入植物人工氣候室進行生長7 d。生長條件：光照強度分為80～100 μmol/（m2·s）、16 h光照、8 h黑暗、溫度22 ℃（白天）/20 ℃（夜晚）、濕度60%。

1.2.2

擬南芥雜交。待擬南芥cat2和Col-0 DR5：：N7-VENUS正常生長到抽薹開花后，取尚未開花的花苞作為母本，開花勢頭較好的花作為父本。將父本的花粉涂抹在已經(jīng)去除勢的母本柱頭上，低光3 d后轉(zhuǎn)正常光照，待莢果成熟后所得即為雜合F1代，自交產(chǎn)生F2代，從中分離出純合的cat2 DR5：：N7-VENUS[21]。

1.2.3

鎘脅迫處理。配制0.1 mol/L CdCl2母液，根據(jù)終濃度將一定體積的CdCl2加入1/2 MS培養(yǎng)基中混勻，倒入一次性培養(yǎng)板待凝固后即可使用，試驗使用工作濃度為0、10、30 μmol/L。在超凈工作臺中，用無菌鑷將6 d的苗移到脅迫培養(yǎng)基中處理4 d，掃描后統(tǒng)計根長。

1.2.4

根長統(tǒng)計及分析。掃描儀掃描10 d左右擬南芥整株形態(tài)，Image-J測量每棵幼苗的主根長度，Excel對數(shù)據(jù)進行計算和分析。

1.2.5

ROS染色（DCFH-DA法）。將DCFH-DA母液加入預(yù)冷的pH 6.0磷酸鉀緩沖液，配成終濃度為含有100 μmol/L DCFH-DA的熒光探針染液，避光保存；取7 d生長狀態(tài)一致的幼苗，低溫孵育15 min后，使用磷酸鉀緩沖液漂洗3～5遍后制片；激光共聚焦觀察熒光信號表達，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm，單通道掃描[22]。

1.2.6

CAT酶活測定。取200～300 mg 擬南芥根部，液氮充分研磨后加入100 mg PVPP，然后加入1.5 mL 0.1 mol/L NaH2PO4/1 mmol/L EDTA（pH 7.5），1 mmol/L ASC，4 ℃，12 000 g，10 min，吸取1 mL上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，置于冰上后備用；使用紫外分光光度計測定CAT酶活，反應(yīng)體系為：880～970 μL緩沖液+20 μL 30%H2O2+10～100 μL酶提取液，充分混勻后，反應(yīng)90 s。記錄30～60 s斜率數(shù)，最后根據(jù)公式計算CAT酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd對Col-0和cat2根長的影響

使用CAT功能缺失突變體cat2探究CAT是否參與植物根部對Cd脅迫的調(diào)控響應(yīng)。選取垂直培養(yǎng)至6 d、大小均一的擬南芥幼苗，使用濃度為0、10、30 μmol/L CdCl2進行4 d脅迫處理。結(jié)果如圖1所示，在1/2 MS培養(yǎng)基上生長的苗的根部隨著Cd濃度的增加，Col-0和cat2根長受到抑制，側(cè)根數(shù)量減少，地上部出現(xiàn)明顯的黃化表型。在30 μmol/L Cd處理條件下，與對照組相比，Col-0和cat2主根根長抑制率約為23%和16%，并無顯著性差異。表明CAT2功能缺失并不影響擬南芥根部對Cd的耐受性。

2.2 不同濃度Cd對ROS積累的影響

重金屬脅迫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，破壞植物體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)，造成植物受到氧化損傷。試驗借助激光共聚焦顯微鏡使用DCFH-DA熒光探針對Cd處理的擬南芥根部ROS積累情況進行分析。正常情況下，Col-0根中的ROS積累較弱，而隨著Cd濃度的增加，根中的ROS逐漸增加。30 μmol/L Cd處理后，Col-0根中的ROS有明顯增加；由于cat2中CAT功能缺失，不能及時清除體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，故體內(nèi)氧化水平處于較高的水平，從圖2可以看出，cat2在0 μmol/L時根部的ROS水平顯著高于Col-0，當cat2受到Cd處理后，體內(nèi)的ROS會隨著Cd濃度的積累而增加。10 μmol/L時，和對照組相比，cat2根部的ROS并沒有顯著變化，而在30 μmol/L時，Col-0、cat2根中ROS都明顯增加，與對照組相比，Col-0的ROS增加了114.7%，cat2增加了93.3%，并無顯著性差異。表明CAT2可能不參與Cd脅迫下擬南芥根對ROS積累的調(diào)控。

2.3 不同濃度Cd對CAT活性的影響

CAT活性能夠反應(yīng)出植物對H2O2的清除能力。取Cd處理7 d后的Col-0、cat2根部，測定其根部CAT活性。從圖3可以看出，隨著Cd濃度的增加，cat2根部的CAT活性均沒有明顯的變化。由于CAT2突變，和Col-0相比，cat2根部的CAT酶活性下降約80%，表明Cd脅迫對擬南芥根的CAT活性沒有明顯影響。

2.4 不同濃度Cd對生長素信號的影響

研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫會影響生長素在植物根中的合成、運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了進一步確定CAT2在擬南芥根響應(yīng)Cd脅迫后生長素的作用，用cat2與生長素報告基因Col DR5：：N7-VENUS雜交從F2代中分離出純合的cat2 DR5：：N7-VENUS，激光共聚焦顯微鏡檢測生長素?zé)晒庑盘柋磉_。結(jié)果如圖4 所示，Col DR5：：N7-VENUS根中生長素表達強烈，但隨著Cd處理濃度的增加，根尖、中柱鞘、外層細胞中熒光強度逐漸減弱，表明Cd脅迫會改變擬南芥根的中生長素信號表達；而對照組中cat2 DR5：：N7-VENUS與Col DR5：：N7-VENUS相比，根中熒光強度降低，30 μmol/L Cd處理后，根中生長素信號隨之降低，進一步分析熒光強度發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，Col-0和cat2的熒光強度分別下降了29.4%和36.6%，并無顯著性差異。

以上結(jié)果表明CAT2缺失可能會減少根中生長素的信號，但并不參與Cd脅迫下擬南芥根部對生長素的調(diào)控。

3 討論

在長期的進化過程中植物演化出多種抵抗重金屬的防御機制，多種抗氧化酶參與植物對重金屬脅迫的響應(yīng)已經(jīng)得到證實。試驗使用Cd濃度梯度處理模式植物擬南芥Col-0和CAT2功能缺失突變體cat2，分析統(tǒng)計主根長度發(fā)現(xiàn)，cat2主根根長的抑制率低于Col-0，說明CAT2可能不參與Cd對擬南芥根長抑制的調(diào)節(jié)。通過測定不同濃度Cd處理后的Col-0、cat2根中的CAT活性，進一步證明cat2受到Cd脅迫后根中的CAT活性無顯著變化。ROS和生長素作為重要的信號分子，廣泛參與到植物生長發(fā)育、新陳代謝、脅迫響應(yīng)等眾多生理生化反應(yīng)的調(diào)控。分析Cd處理后根中的ROS積累發(fā)現(xiàn)，CAT2不參與到Cd脅迫下擬南芥根中對ROS的調(diào)控。通過比較根中生長素報告基因的熒光強度，發(fā)現(xiàn)CAT2也不參與Cd脅迫抑制根中生長素的信號表達的調(diào)控。

研究報道，鎘處理玉米幼苗后，根中CAT的活性和蛋白含量會下調(diào)，而轉(zhuǎn)錄水平會隨著處理時間而增加，并改變轉(zhuǎn)錄后的蛋白空間結(jié)構(gòu)[23]。當小麥受到Cd脅迫后，CAT活性降低會抑制K+/Na+比率，進而破壞離子通道的正常交換，影響擴膜運輸效率[24]。而該試驗發(fā)現(xiàn)擬南芥受到鎘脅迫后，根中CAT酶活并未發(fā)生顯著變化，這可能由于不同植物對鎘的耐受能力是不同的，鎘脅迫并未改變CAT轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。

谷胱甘肽（GSH）在植物抵抗逆境脅迫過程中起著重要作用。研究報道，植物中的GSH可以螯合Cu和Cd，降低細胞內(nèi)游離的重金屬濃度，這些復(fù)合物隨之轉(zhuǎn)移到液泡并排出體外，從而減輕重金屬對植物的毒害作用。擬南芥可能通過GSH途徑參與調(diào)控Cd脅迫。

綜上所述，CAT2不參與調(diào)控擬南芥根部對鎘脅迫的耐受性，并且不參與ROS積累、生長素信號表達的調(diào)控。

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