張川　徐志進(jìn)　柳敏海

摘要[目的]比較不同的碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)斯魯菲亞海洋紅酵母（Rhodotorula slooffiae）菌株產(chǎn)量的影響，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分。[方法]通過葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4因素3水平的正交試驗(yàn)，確定斯魯菲亞海洋紅酵母的最優(yōu)培養(yǎng)基。[結(jié)果]斯魯菲亞海洋紅酵母的最優(yōu)培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀1%。接種量6%，500 mL三角錐形瓶，裝液量100 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，經(jīng)過48 h培養(yǎng)，菌種量最大可達(dá)8.6×108 CFU/mL，比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。[結(jié)論]培養(yǎng)條件和工藝的優(yōu)化可以顯著提高海洋紅酵母菌量和類胡蘿卜素含量。

關(guān)鍵詞海洋紅酵母；發(fā)酵；培養(yǎng)條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0001-03

Fermentation Conditions Optimization of Rhodotorula slooffiae

ZHANG Chuan，XU Zhijin，LIU Minhai et al

（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province， Zhoushan，Zhejiang 316000）

Abstract[Objective]The effects of different carbon sources， nitrogen sources and inorganic salts on fermentation yield of marine red yeast（Rhodotorula slooffiae） were compared to determine the optimal medium components. [Method]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined by 4 factors and 3 levels orthogonal test.[Result]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined： glucose 2%， yeast extract powder 0.75%， ammonium sulfate 0.5%， monopotassium phosphate 1%， and inoculation amount 6%， temperature 30 ℃， 100 mL medium in 500 mL triangle bottle and fermentation time 48 h. Under above conditions， the cell biomass of marine red yeast can reach 8.6×108 cfu/mL， which increased by 30% as compared with the fermentation before optimization. [Conclusion]Optimization of culture conditions and process can significantly increase the amount of marine red yeast and carotenoid content.

Key wordsMarine red yeast；Fermentation；Conditions optimization

海洋紅酵母（Rhodotorula slooffiae）是存在于海水中的一種單細(xì)胞酵母品系，大部分分布在海水和海底沉積物中，通過合成各種酶和代謝產(chǎn)物，可以在極端環(huán)境下生存；也有一些種類寄附在魚蝦和貝類上，互利共生[1-2]。海洋紅酵母富含豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、天然色素、維生素等生物活性物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，此外還可以使水產(chǎn)動(dòng)物色澤亮麗，肉質(zhì)鮮美，常被作為水產(chǎn)動(dòng)物育苗的開口餌料[3-4]。海洋紅酵母中含有的葡聚糖和甘露糖蛋白等成分，使其能刺激宿主的免疫和抗氧化系統(tǒng)，提高抗氧化、生物免疫力和抗基因毒性等功能[5]。養(yǎng)殖飼料中添加海洋紅酵母可以有效提高水產(chǎn)動(dòng)物幼苗的存活率和抗病能力，還可以提高蝦青素在動(dòng)物體內(nèi)的積累，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和惡劣環(huán)境耐受力[6]。

在生態(tài)環(huán)境修復(fù)方面，海洋紅酵母可以將烴類化合物降解為小分子物質(zhì)，吸收重金屬離子，處理海洋污染。水體酸化方面應(yīng)用廣泛。海洋紅酵母能夠促進(jìn)腸道中益生菌的生長(zhǎng)繁殖，起到調(diào)整腸胃的發(fā)酵過程以及pH，有助于腸胃平時(shí)的消化吸收活動(dòng)，其作為食品添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品加工中[7]。

近年來，關(guān)于海洋紅酵母的研究逐漸增加，主要集中在菌種的選育、代謝產(chǎn)物的測(cè)定、發(fā)酵工藝優(yōu)化和促進(jìn)類胡蘿卜素合成等方面。優(yōu)化海洋紅酵母的發(fā)酵工藝具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該研究從選擇最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽及最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)入手，優(yōu)化斯魯菲亞海洋紅酵母培養(yǎng)基，提高產(chǎn)率降低成本，旨在為該菌株的下一步工業(yè)化發(fā)酵罐生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1菌種

1.1.1菌種來源。

海洋紅酵母，由遼東學(xué)院提供，菌株培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基。

1.1.2培養(yǎng)基。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2.0%，陳海水100 mL，自然pH。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，硫酸銨1.0%，酵母浸粉1%，磷酸二氫鉀1%，陳海水100 mL，自然pH。

1.1.3菌株培養(yǎng) 。

斜面活化。保存于冰箱中的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上活化，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.1.4搖床擴(kuò)陪。從斜面培養(yǎng)基上接種到500 mL三角錐形瓶中，裝液量為80 mL，30 ℃，160 r/min，培養(yǎng)24 h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6%的接種量，接入裝量100 mL的500 mL 錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為180 r/min。

1.1.5酵母菌的生理生化鑒定。

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[8]和《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[9]對(duì)海洋紅酵母進(jìn)行糖源發(fā)酵、碳源同化、氮源同化等生理生化試驗(yàn)。

1.2培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.1單因素試驗(yàn)。

以種子培養(yǎng)基為基準(zhǔn)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基要素，其中，

碳源試驗(yàn)：以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源，含量為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%～2%），培養(yǎng)條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養(yǎng)容器為三角錐形瓶；培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

氮源試驗(yàn)：分別以硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸粉為氮源，含量設(shè)置為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%；培養(yǎng)條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養(yǎng)容器：三角錐形瓶；培養(yǎng)時(shí)間4 8 h。

無機(jī)鹽試驗(yàn)：以磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣為其他無機(jī)成分，含量為同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%～2%），培養(yǎng)條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養(yǎng)容器：三角錐形瓶；培養(yǎng)時(shí)間48 h。

以海洋紅酵母生物量為參考指標(biāo)，挑選適宜的碳源、氮源和無機(jī)鹽以及培養(yǎng)基用量。

1.2.2正交試驗(yàn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4個(gè)因素，各取3個(gè)水平（表1），共設(shè)有9個(gè)組，每組有3個(gè)平行對(duì)照，取各數(shù)據(jù)平均值，篩選出最優(yōu)組合。

1.3細(xì)胞生物量測(cè)定

采用血球板計(jì)數(shù)法，將取出的發(fā)酵液稀釋100倍，用膠頭滴管吸取后滴到血球計(jì)數(shù)板上，用蓋玻片蓋好，放于顯微鏡40倍鏡下觀察并找到網(wǎng)格，換100倍鏡計(jì)數(shù)[8]。

1.4類胡蘿卜素提取與測(cè)定

采用丙酮法萃取得到類胡蘿卜素提取液，使用分光光度計(jì)在475 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式計(jì)算：色素含量（μg/g干菌體）=Amax×D×V/0.16W，式中，A為475 nm波長(zhǎng)處的吸光度，V為丙酮的用量（mL），D為測(cè)定試樣時(shí)的稀釋倍數(shù)，W為酵母菌干重（g），0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)[10]。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌生長(zhǎng)曲線

發(fā)酵培養(yǎng)后，從0 h開始，每隔6 h取樣一次，進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)，并繪制該菌株生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。從圖1可以看出，在接種6 h之后，菌體即快速生長(zhǎng)，6～36 h菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期快速增長(zhǎng)，菌的數(shù)量達(dá)到最高6.6×108 CFU/mL，36 h后菌數(shù)下降，之后逐漸進(jìn)入衰亡期。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1最佳碳源和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

用4種不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉）作比較試驗(yàn)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同（1%），在其他成分相同的情況下，斯魯菲亞紅酵母對(duì)4種碳源都能夠同化，其中對(duì)葡萄糖利用效果最好（表2）。以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，酵母菌的生物量達(dá)到5.6×108 CFU/mL；而使用淀粉作為碳源效果最差，酶母菌的生物量只有3.7×108 CFU/mL。麥芽糖在提高菌體中類胡蘿卜素含量方面效果最好，葡萄糖次之，蔗糖最差。

以葡萄糖作為碳源，選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%時(shí)，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌量也在增大，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到2%時(shí)菌數(shù)最高；當(dāng)葡萄糖濃度大于2%時(shí)，菌數(shù)逐漸下降，當(dāng)葡萄糖濃度為5%時(shí)，菌數(shù)最低只有4.8×108 CFU/mL。綜上所述，選擇2%葡萄糖作為碳源，海洋紅酵母的產(chǎn)量最高，達(dá)到6.2×108 CFU/mL，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高過低都不利于紅酵母增殖。

2.2.2最佳氮源的確定。

用4種不同的氮源（蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、酵母浸粉）作比較試驗(yàn)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同（1%），在其他成分相同的情況下，發(fā)現(xiàn)含有酵母浸粉的培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)更有利，菌數(shù)最高可達(dá)5.57×108 CFU/mL（表3）。有機(jī)氮源對(duì)菌生物量的促進(jìn)作用高于硫酸銨、氯化銨這些無機(jī)氮源；但無機(jī)氮源更有益于類胡蘿卜素含量的增加[11]。通過無機(jī)氮源和有機(jī)氮源的科學(xué)調(diào)配可以實(shí)現(xiàn)對(duì)海洋紅酵母發(fā)酵后期效價(jià)單位的漲幅調(diào)控和生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，所以應(yīng)該在培養(yǎng)基中選擇一定量的硫酸銨搭配酵母浸粉使用[12]。

2.2.3最佳無機(jī)鹽的確定。

用3種無機(jī)鹽（磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂）作比較試驗(yàn)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同（1%），在其他成分相同的情況下，發(fā)現(xiàn)含有磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)和類胡蘿卜素的合成促進(jìn)作用更明顯（表4）。

以磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽，檢驗(yàn)不同濃度下磷酸二氫鉀對(duì)海洋紅酵母生物量的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.0%，酵母菌生物量隨著鹽濃度升高而增加。無機(jī)鹽濃度在1.0%～2.0%時(shí)，鹽濃度抑制酵母菌量的增長(zhǎng)，在2.0%～2.5%時(shí)生物量又略有上升。總體來說，培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，菌數(shù)最大為4.72×108 CFU/mL。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分。使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性差異分析。從表5可知，4種因素對(duì)斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發(fā)酵菌量影響各不相同，順序?yàn)锽>A>D>C。硫酸銨濃度變化對(duì)海洋紅酵母菌數(shù)影響不顯著（P>0.05），酵母浸粉濃度的變化對(duì)海洋紅酵母菌數(shù)具有顯著性影響（P<0.05），其最適濃度為0.75%。海洋紅酵母菌數(shù)最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B3C1D2，即葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，在此優(yōu)化條件下海洋紅酵母菌量可達(dá)8.6×108 CFU/mL，比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。

3結(jié)論與討論

對(duì)斯魯菲亞海洋紅酵母進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，對(duì)于提高菌的生物量而言葡萄糖效果最好，最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%；最佳氮源為酵母粉和硫酸銨，最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.75%和0.5%；無機(jī)鹽中1.0%磷酸二氫鉀效果最好。在此培養(yǎng)條件下，海洋紅酵母菌量最大可達(dá)到8.6×108 CFU/mL，比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。正交試驗(yàn)中4種因素對(duì)斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發(fā)酵菌量影響各不相同，其中酵母浸粉>葡萄糖>磷酸二氫鉀>硫酸銨。需要指出的是配比3%葡萄糖、0.75%酵母浸粉、1%硫酸銨、1%磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基，紅酵母菌量達(dá)到8.4×108 CFU/mL，實(shí)際生產(chǎn)過程中可以根據(jù)原料來源和成本綜合考量，選擇最優(yōu)配比。

海洋紅酵母是海洋環(huán)境中重要的菌種資源，其所含有的豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)，使其具有廣泛的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)海洋紅酵母的研究大多集中在菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和促進(jìn)類胡蘿卜素合成等方面的研究。而培養(yǎng)基中不同的pH、溫度、光照和接種量也會(huì)影響紅酵母的生物量和類胡蘿卜素的產(chǎn)量[13-14]，添加不同金屬離子和氨基酸對(duì)海洋紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有重要的影響[3]。綜上研究可見，不同的培養(yǎng)條件和工藝對(duì)海洋紅酵母的生長(zhǎng)和色素的合成有很大的影響，所以進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化海洋紅酵母的培養(yǎng)條件，能為海洋紅酵母的開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐意義[15]。

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