許蘭杰　梁慧珍　余永亮

摘要對金銀花在我國的分布及基因型分類進(jìn)行分析，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子生物學(xué)技術(shù)對中藥金銀花植物的遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期全面準(zhǔn)確地了解金銀花的遺傳多樣性并對其進(jìn)行保護(hù)，同時為開展金銀花遺傳改良提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞金銀花；種質(zhì)資源；遺傳多樣性

中圖分類號S567.+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2018）28-0022-03

Research Progress of Genetic Diversity of Germplasm Resources of Lonicera japonica

XU Lanjie，LIANG Huizhen，YU Yongliang et al（Sesame Research Center，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou ，Henan 450002）

AbstractDistribution and gene classification of Lonicera japonica were analyzed.Genetic diversity was studied by morphological marker，biochemical marker and molecular markers in Lonicera japonica.This research can provide theoretical basis for genetic improvement of Lonicera japonica.

Key wordsLonicera japonica；Germplasm resources；Genetic diversity

金銀花為忍冬科植物中中醫(yī)的常用藥物，金銀花富含芳樟醇和雙花醇等揮發(fā)油，以及綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸，黃酮類和皂苷類等化學(xué)成分，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效[1]。金銀花的花、葉和莖均可入藥。宋代以前只用莖和葉，明代則莖、葉、花同等入藥。但是不同部位其化學(xué)成分不同，功效不同。我國主要金銀花種質(zhì)資源有忍冬屬植物98種，5亞種，18變種，在全國分布較廣，可供藥用的達(dá)49種。我國是金銀花的主產(chǎn)國，2003年，全國金銀花種植面積在0.2萬hm2以上，年產(chǎn)量8 000 t，而當(dāng)時國內(nèi)外市場需求量為20 000 t。2010年種植面積超過5.33萬hm2。金銀花壽命一般為10～20年，栽種3年后就可以產(chǎn)生效益，5年達(dá)到盛產(chǎn)。該研究主要對我國金銀花種質(zhì)資源分類進(jìn)行闡述，并綜述種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展。

1我國金銀花種質(zhì)資源研究

1.1我國金銀花主要產(chǎn)區(qū)分布

我國金銀花分布甚廣，主產(chǎn)于河南、山東，主要為栽培品種，此外，四川、廣西、江西、江蘇、陜西和甘肅等地均有野生[2]。

山東金銀花集中產(chǎn)于沂蒙山區(qū)，包括平邑、費(fèi)縣、沂水、臨沭、濟(jì)南等地，已有300余年的栽培歷史，全省各山地丘陵均有野生。主要有毛花系列，包括小毛花、大毛花、九豐一號；雞爪花系列，包括小雞爪花、大雞爪花、細(xì)毛針（線花）、紅褲腿、麻針、大麻葉、中金一號等；野生花系列，包括野生忍冬、紅梗子；其他類，包括灰氈毛忍冬、紅金銀花。推廣種植的有費(fèi)縣“中金一號”、平邑“九豐一號”。

河南是傳統(tǒng)的金銀花道地產(chǎn)地和栽培地，產(chǎn)于河南的稱為“南銀花”或“密銀花”。河南金銀花主產(chǎn)區(qū)有鄭州市所轄的新密、鞏義、滎陽等縣市，新鄉(xiāng)市所轄的封丘、原陽、輝縣、濮陽、許昌所轄禹州等縣，洛陽所轄汝州、偃師等縣，以及焦作、信陽、南陽的部分山區(qū)。近些年，在各地研究部門的培育下，出現(xiàn)諸多優(yōu)良品種，基本上可以分為三大品系，即毛花系、雞爪花系和野生銀花系，共計(jì)十余個品種，種植規(guī)模較大的品種有“原陽一號”“豫封”系列、“封丘大毛花”“雞爪花”系列、“鑫蕾一號”、河南封丘“金豐一號”等。

其他產(chǎn)地如四川省可供藥用的主流品種為灰氈毛忍冬、細(xì)氈毛忍冬和淡紅忍冬；浙江省的主流品種為忍冬、紅腺忍冬、灰氈毛忍冬；甘肅省主流品種為盤葉忍冬、細(xì)氈毛忍冬和淡紅忍冬；湖南省主流品種為灰氈毛忍冬，此外，各個地區(qū)還有分布廣泛的野生忍冬植物。

1.2我國金銀花種質(zhì)分類研究

1.2.1形態(tài)學(xué)分類研究。

植物形態(tài)學(xué)是最直觀的分類方式，目前已經(jīng)應(yīng)用于白芍、蒼耳等中藥植物的鑒別。張芳[3]依據(jù)金銀花植株形態(tài)特征差異證實(shí)了山東主產(chǎn)地的金銀花植株確實(shí)存在不同的種質(zhì)，不同種質(zhì)植株的形態(tài)特征與同工酶酶譜之間具有密切的關(guān)系，同工酶譜一致的植株形態(tài)特征相近。周鳳琴等[4]采用盛花期與非花期結(jié)合的方法進(jìn)行種質(zhì)調(diào)查，依據(jù)植物形態(tài)分類學(xué)知識進(jìn)行品種的初步劃分，將主要金銀花種質(zhì)劃分為3個系列16個品種。李林等[5]對浙江樂清、永嘉以及文成的金銀花進(jìn)行調(diào)查，依據(jù)植物形態(tài)分類學(xué)知識將其原植物分為紅腺忍冬、灰氈毛忍冬以及引種河南的正品忍冬，野生種質(zhì)在浙江也有分布，但是資源分散，未能夠形成商品。周鳳琴等[6]依據(jù)盛花期和非盛花期的植株形態(tài)差異對我國金銀花主產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查、收集與初步鑒定，確定山東平邑、河南新密為金銀花的道地產(chǎn)區(qū)，河南封丘、河北巨鹿為金銀花的新產(chǎn)區(qū)，山東平邑是中國金銀花種質(zhì)資源分布中心。藍(lán)云龍等[7]采用形態(tài)性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)浙江西南地區(qū)的6個野生金銀花在形態(tài)性狀上差異較小。

1.2.2DNA水平上分類研究。

于燕莉等[8]采用RAPD標(biāo)記方法對金銀花兩品系的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析，證明RAPD技術(shù)可以有效地用于金銀花品種的分類與鑒別。蔣超等[9]利用15對堿基數(shù)差異大于6的EST-SSR對52份金銀花類藥用植物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)引物jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。牛偉濤等[10]采用10個RAPD隨機(jī)引物成功構(gòu)建巨鹿金銀花DNA指紋圖譜，可快速準(zhǔn)確地將巨鹿金銀花與其他兩產(chǎn)地金銀花鑒別區(qū)分。徐石勇等[11]基于SNP標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合高分辨率溶解曲線分析技術(shù)（high resolution melting， HRM）對金銀花和山銀花的標(biāo)志性SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，可以快速地鑒別金銀花藥材的真?zhèn)巍?/p>

2金銀花種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

2.1蛋白質(zhì)水平

同工酶是基因編碼的產(chǎn)物，其酶譜差異主要是由決定酶蛋白本身的等位基因或非等位基因的差異造成的，同工酶電泳圖譜譜帶發(fā)生多態(tài)性變化，反映了生物在蛋白質(zhì)水平上的多型性，是生物發(fā)生遺傳分化的證據(jù)[12]。目前，同工酶標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于三七[13]、枸杞等[14]中藥種質(zhì)的遺傳多樣性研究。趙永亮等[15]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)，利用過氧化物同工酶和淀粉酶同工酶對10個地區(qū)11個金銀花樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，表明不同產(chǎn)區(qū)金銀花的過氧化物酶和淀粉酶具有較豐富的多態(tài)性，說明金銀花不同居群在遺傳本質(zhì)上是有區(qū)別的；聚類分析表明10個產(chǎn)區(qū)的11個金銀花樣品可聚為3個類群；不同產(chǎn)區(qū)金銀花的親緣關(guān)系與其遺傳本質(zhì)和地理位置有關(guān)。

2.2DNA水平

2.2.1SSR標(biāo)記。SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。徐石勇等[11]選擇25個SSR位點(diǎn)用于6個金銀花供試材料多態(tài)性分析，構(gòu)建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，可對金銀花及其變種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28；應(yīng)用該指紋圖譜對87個市售金銀花進(jìn)行分析，能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。

2.2.2RAPD標(biāo)記。

向增旭等[16]利用RAPD分析技術(shù)對金銀花（Lonicera aponica Thunb.）6個種源的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)23個引物共擴(kuò)增出多態(tài)性片段83條，金銀花的6個種源可聚為兩大類，產(chǎn)自山東平邑、湖南隆回和江蘇南京的野生金銀花種源遺傳距離較近，聚為一類；來自河南封丘的2個野生種源和來自河南密縣的1個栽培種源聚為一類。不同金銀花種源間的遺傳關(guān)系與地理分布有一定的相關(guān)性。蔣向輝等[17]用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對7個不同來源的金銀花品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)以遺傳距離14.0 cM為界，可將7個不同金銀花種質(zhì)分為三大類；第Ⅰ類為湘蕾金銀花與華南忍冬，第Ⅱ類為巨花1號與金塔1號，第Ⅲ類為九豐1號、魯峰巨豐與金花3號。趙東岳等[18]利用RAPD技術(shù)分析國內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)采集的11份栽培金銀花和1份山銀花樣品，17條RAPD引物共擴(kuò)增出150條清晰可辨的DNA條帶；表明河南封丘、河北巨鹿的金銀花品種遺傳差異較小，品種較為單一；山東平邑的金銀花種質(zhì)資源相對豐富；不同金銀花種源間的遺傳關(guān)系與地理分布存在相關(guān)性。Fu等[19]采用18對RAPD引物對5個金銀花品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出147條帶，片段大小在300～2 000 bp，每個引物3～11個擴(kuò)增片段；發(fā)現(xiàn)5個金銀花品種的相關(guān)性在0.59～0.77。 王一斐等[20]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對膠東地區(qū)31個金銀花品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，5個引物共擴(kuò)增出650條帶；聚類分析結(jié)果表明，31個金銀花品種可以分為兩大類，采自昆崳山太白頂?shù)慕疸y花品種為一類，其余30個金銀花品種為一類。從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂?shù)钠贩N與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種大毛花遺傳距離最遠(yuǎn)，為2.507；采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塔（Ⅱ）與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020?？梢钥闯霾煌疸y花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關(guān)系與地理分布有一定的相關(guān)性。

2.2.3ISSR。

王曉明等[21]利用10條ISSR引物對以湖南、山東、河南的22個金銀花主要栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶96條；22個金銀花品種間的遺傳相似性系數(shù)為0.41～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.68；利用U PGM A進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，22個供試金銀花品種劃分為兩大類，第1類為忍冬種群，第2類為灰氈毛忍冬種群，每個大類又分為北方種群與南方種群。王珊[22]采用15條具有多態(tài)性且重復(fù)性好的引物對湖南省不同產(chǎn)區(qū)的灰氈毛忍冬樣品進(jìn)行ISSR標(biāo)記研究，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶161條，遺傳相似性系數(shù)變化在0.39～0.91?？涤袂颷23]采用ISSR分子標(biāo)記對12個雞爪花品系金銀花進(jìn)行分析， 15條引物共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶240條，表明雞爪花品系金銀花的遺傳多樣性豐富，12個雞爪花品系金銀花品種可按地域性分為山東與河南新密兩大類，同一道地產(chǎn)區(qū)栽培品種的親緣關(guān)系較近；各農(nóng)家品種間遺傳相似系數(shù)的變化在0.640 8～0.873 8。王湘瑩等[24]采用10個重復(fù)性高、擴(kuò)增效果好的ISSR引物對23個金銀花品種的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得多態(tài)性條帶169條，23個金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)在0.471 3～0.100 0，表明品種間的遺傳基礎(chǔ)較寬及遺傳多樣性較高。聚類分析（UPGMA）表明：23個供試金銀花品種劃分為忍冬、美國忍冬、灰氈毛忍冬三大類。韓琳娜等[25]應(yīng)用16個多態(tài)性ISSR引物對27個金銀花原植物種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多態(tài)性、相似性和聚類分析；遺傳相似系數(shù)在0.50～0.90；27個品種可被聚為2個類群。孫稚穎等[26]對采自金銀花主產(chǎn)區(qū)的18個農(nóng)家品種及 野生忍冬和近緣種灰氈毛忍冬共計(jì)36個樣品進(jìn)行 ISSR-PCR 分析， 12條引物共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶為114條，表明金銀花種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。 綜上所述，利用 ISSR標(biāo)記可有效地分析金銀花種質(zhì)資源的遺傳變異，為金銀花品種鑒別、分類、種質(zhì)資源的有效利用提供理論依據(jù)。

2.2.4AFLP。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是通過對基因組DNA的限制性酶切片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增而揭示其多態(tài)性，具有靈敏、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)。利用AFLP技術(shù)在丹參[27]、黃蘗[28]等中藥種質(zhì)資源中開展了遺傳多樣性研究。郭慶梅等[29]采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)對13個忍冬農(nóng)家品種的遺傳多樣性進(jìn)行初步分析，共獲得191條多態(tài)性條帶，表明同一道地產(chǎn)區(qū)的栽培品種親緣關(guān)系較近，山東種質(zhì)基于AFLP標(biāo)記的分類結(jié)果與形態(tài)特征基本一致。

3存在的問題與展望

我國金銀花育成品種栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，但是金銀花相對遺傳基礎(chǔ)狹窄，基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢，大大制約了金銀花種質(zhì)資源的開發(fā)利用和保存，導(dǎo)致金銀花品種退化、道地性差等問題。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對金銀花資源的收集、分類、種質(zhì)評價及利用方面開展了很多研究，并取得諸多成果，使得金銀花的用途更加廣泛和明確。利用分子標(biāo)記技術(shù)對金銀花進(jìn)行合理分類、發(fā)現(xiàn)、鑒定和利用，將會有利于挖掘和利用我國的各種金銀花種質(zhì)資源，提高育種效率，解決由于長期不規(guī)范的選育，金銀花的種質(zhì)嚴(yán)重退化、盲目引種等問題。

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