李漢生 姚德恒 陳曉慧 劉煒?gòu)O 陳裕坤 林玉玲 王云 賴鐘雄

摘 要 采用攪拌式生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)龍眼懸浮細(xì)胞，探討藍(lán)光對龍眼細(xì)胞生長及類黃酮積累的影響?；谝呀⒉?yōu)化的龍眼細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，首先研究龍眼細(xì)胞在黑暗和藍(lán)光的培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長量、類黃酮含量、細(xì)胞活力、培養(yǎng)液的底物消耗量等的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：龍眼細(xì)胞培養(yǎng)9 d后，藍(lán)光的細(xì)胞干重比黑暗增長了0.28 g/L，類黃酮含量增長了0.77 mg/g。細(xì)胞培養(yǎng)前期藍(lán)光的培養(yǎng)液蔗糖消耗速度慢于黑暗培養(yǎng)，此后蔗糖含量均穩(wěn)定在2 g/L。培養(yǎng)過程中，藍(lán)光培養(yǎng)的還原糖含量均高于黑暗培養(yǎng)，藍(lán)光的磷酸鹽的消耗量基本大于黑暗培養(yǎng)。其次，通過qPCR技術(shù)分析光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5、調(diào)控基因DlPAP1及類黃酮途徑合成基因DlCHS的表達(dá)差異。結(jié)果表明藍(lán)光可能通過光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5調(diào)控基因DlPAP1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控龍眼類黃酮代謝途徑合成基因DlCHS的表達(dá)，從而導(dǎo)致類黃酮的積累。

關(guān)鍵詞 龍眼；細(xì)胞培養(yǎng)；生物反應(yīng)器；藍(lán)光；類黃酮

中圖分類號 S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The effects of blue light on the growth of longan cells and flavonoid accumulation were investigated using a stirred bioreactor with enlarged culture of longan cells in this study. Based on the established and optimized suspension culture system of longan cells， the changes of the growth of cells， flavonoid contents， cell vitality， substrate consumption and so on were firstly studied in the dark and blue light treatments. Results found that the dry weight of blue light increased by 0.28 g/L and the flavonoid contents increased by 0.77 mg/g after 9 days culture. The sucrose consumption under blue light was slower than that under the darkness in the early stages of culture， and then the sucrose contents were stable at 2 g/L. In the process of culture， the contents of reducing sugar under blue light was higher than that under darkness， and the phosphate consumption under blue light was more than that under darkness. Then， the expression of light signal transcription factor DlHY5， regulatory gene DlPAP1 and flavonoid biosynthesis pathway structural gene DlCHS were analyzed by qPCR. Results indicated that the regulation of flavonoid accumulation in longan by blue light is probably through the light signal transcription factor DlHY5， and then regulated the expression of flavonoid biosynthesis pathway regulatory gene DlPAP1 and structural genes DlCHS.

Keywords Dimocarpus longan Lour.； cell culture； bioreactor； blue light； flavonoids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.013

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無患子科（Sapindaceae）龍眼屬植物，具有很高的藥用和營養(yǎng)價值，自古以來被視為珍貴的補(bǔ)品。龍眼中藥用成分眾多，主要的次生代謝產(chǎn)物就包括類黃酮物質(zhì)[1]。類黃酮在植物體內(nèi)具有重要的生理學(xué)意義，它們控制著生長素的運(yùn)輸、紫外保護(hù)和抵御作用等[2]。另外，黃酮類化合物也是一種生物性很強(qiáng)的天然氧化劑，具有抗癌防癌、抗衰老等醫(yī)療保健功能[2]。

類黃酮的提取主要以植物果皮、果肉、果核、葉片等為材料，存在培養(yǎng)周期較長、成本高等諸多局限。而通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)植物細(xì)胞具有環(huán)境可調(diào)控、周期短、生產(chǎn)效益高、投資少等優(yōu)勢[3]。本實(shí)驗(yàn)室的攪拌式反應(yīng)器（Biostat? B， Sartorius Stedim Biotech）是近年來出現(xiàn)的新型細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，較傳統(tǒng)的反應(yīng)器具有智能化程度高、實(shí)時監(jiān)測、易保持無菌狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)。目前，已經(jīng)超過200種藥用植物進(jìn)行過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究，但只有少數(shù)植物實(shí)現(xiàn)了工廠化，其中以紅豆杉懸浮細(xì)胞[4]、紫草懸浮細(xì)胞[5]大規(guī)模培養(yǎng)為代表性成果。而關(guān)于龍眼懸浮細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的相關(guān)研究至今無人報道。

在植物懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，前人已通過不同的方法來刺激代謝途徑以調(diào)控目標(biāo)次生產(chǎn)物的合成量，其中光調(diào)控被看作改變植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物合成的重要方法之一[6]。關(guān)于貫葉連翹懸浮細(xì)胞的研究表明，光照對懸浮細(xì)胞生長量和類黃酮含量有著促進(jìn)作用[7]。鐘春水等[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照條件下金花茶懸浮細(xì)胞生長量得到了提升，且光照對PPO（PolypHenol oxidase）、DFR（Dihydroflavonol4-reductase）、LAR（Leucoanthocyanidin reductase）3個基因的表達(dá)量及兒茶素總量均有極顯著影響。植物對光的響應(yīng)途徑是復(fù)雜且精細(xì)的，HY5（Long Hypocotyl 5）作為光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控因子，能夠正調(diào)控類黃酮的合成[6]。而HY5調(diào)控類黃酮的合成是通過轉(zhuǎn)錄因子PAP1（an R2R3-MYB transcription factors）的轉(zhuǎn)錄激活[9]。另外，CHS （Chalcone sythase）是類黃酮代謝合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶[10]。

在本實(shí)驗(yàn)室董慧雪等[11]關(guān)于不同光質(zhì)對龍眼愈傷組織類黃酮含量的影響研究中，就已發(fā)現(xiàn)藍(lán)光最有利于促進(jìn)類黃酮的積累。因此，本研究采用攪拌式生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)龍眼懸浮細(xì)胞，探討藍(lán)光對龍眼細(xì)胞生長及類黃酮積累的影響。基于已建立并優(yōu)化的龍眼細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系[12]，首先研究了龍眼細(xì)胞在黑暗和藍(lán)光的培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長量、類黃酮含量、細(xì)胞活力、培養(yǎng)液的底物消耗量（蔗糖、還原糖、磷酸鹽）、培養(yǎng)體系的pH及溶氧的變化情況等；其次，通過qPCR技術(shù)對光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5、調(diào)控基因DlPAP1、類黃酮途徑合成基因DlCHS進(jìn)行表達(dá)量差異分析，探討藍(lán)光對龍眼類黃酮合成的分子機(jī)制。這些研究將為龍眼細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)類黃酮的工業(yè)化進(jìn)程提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系參照賴鐘雄等[12]建立的方法。在生物反應(yīng)器中，龍眼懸浮細(xì)胞采用MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2，4D+100 mg/L肌醇的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。龍眼幼胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞、不同組織部位的材料均來源于‘紅核子品種。

1.2 方法

1.2.1 龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件 龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)參照賴鐘雄等[13]建立的方法，并應(yīng)用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)（表1）。

1.2.2 龍眼細(xì)胞的生長量測定 收集第1～9天的龍眼懸浮細(xì)胞，離心后去除多余培養(yǎng)液，于-20 ℃保存后進(jìn)行凍干，最后測定干重。

1.2.3 龍眼細(xì)胞中類黃酮含量測定 總黃酮提取參照李琨等[14]的方法并適當(dāng)改良。將龍眼愈傷組織進(jìn)行凍干處理2 d，天平稱取0.2 g材料，首先加入60%的乙醇溶液10 mL，通過超聲波清洗器（KQ-200SPDE）提取1 h（60 ℃，功率300 w），冷卻靜置20 min，再通過離心機(jī)（TGL-15B）離心10 min（8 000×g，20 ℃）。然后吸取5 mL上清液于新試管中，并稀釋至10 mL。最后取龍眼愈傷組織提取液5 mL，精確加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液（NaNO2），搖勻后放置6 min，加入0.3 mL10% 硝酸鋁溶液（Al（NO3）3），搖勻后放置 6 min，加入4 mL 20% 氫氧化鈉溶液（NaOH），加入10 mL 60%乙醇溶液定容至10 mL刻度線，搖動均勻并靜置15 min。通過紫外可見分光光度計（T6）檢測吸光度，波長設(shè)置為510 nm，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算龍眼愈傷組織的類黃酮含量。

1.2.4 細(xì)胞活性測定 細(xì)胞活性測定參照張建文等[15]

的方法并適當(dāng)改良：培養(yǎng)液中龍眼懸浮細(xì)胞經(jīng)8 μm濾膜抽濾后，在15 mL的試管中加入0.5 g鮮重龍眼細(xì)胞、2.5 mL 0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液（pH為7.0）、2.5 mL質(zhì)量濃度為4 g/L 的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液；接著將溶液混勻后，置于25℃溫度下暗處理13-16 h，離心去上清液，并用蒸餾水漂洗3次；然后向龍眼細(xì)胞中加入5 mL甲醇，60 ℃水浴50 min，期間搖動數(shù)次；最后在室溫下放置至細(xì)胞無色，離心后取上清液，通過分光光度計測定吸光值A(chǔ)，波長為485 nm。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)底物消耗量測定 可溶性糖的測定參照苯酚法[16]并適當(dāng)改良，收集1～9 d龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液，在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。吸?.5 mL培養(yǎng)液于規(guī)格為50 mL的試管中，然后加入1 mL 9%苯酚溶液，再慢速加入5 mL濃硫酸，將試管溶液搖動混勻，最后加入蒸餾水并將其定容到10 mL。常溫下靜置30 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，吸取1 mL待測液于規(guī)格為20 mL的新試管，用蒸餾水稀釋至15 mL，并通過分光光度計測定吸光度，波長設(shè)置為485nm，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)液的蔗糖含量。

還原糖的測定參照3，5-二硝基水楊酸法[17]并適當(dāng)改良，吸取2 mL培養(yǎng)液于規(guī)格為50 mL的試管中，再向培養(yǎng)液中加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，將試管溶液搖動均勻。通過90 ℃水浴鍋（JK-WB-4A）中加熱5 min，取出試管后，立即進(jìn)行冷卻，再加入蒸餾水并將其定容到20 mL，搖動均勻。并通過分光光度計測定吸光度，波長設(shè)置為540 nm，根據(jù)所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出培養(yǎng)液的還原糖含量。

磷酸鹽參照李永遠(yuǎn)等[18]的測定方法并適當(dāng)改良：吸取5 mL培養(yǎng)液于規(guī)格為50 mL試管中，首先加入3 mL鉬酸鈉-硫酸溶液，再向溶液中加入0.4 mL硫酸肼溶液，將試管搖動均勻，通過90 ℃水浴鍋中加熱10 min后，立即放入冷水中進(jìn)行冷卻。并通過分光光度計測定吸光度，波長設(shè)置為660 nm，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)液的磷酸鹽含量。

1.2.6 溶氧量測定 PO2（溶氧量）的值通過Sartorius Stedim Biotech的光學(xué)傳感器技術(shù)進(jìn)行測量。傳感器被集成到各種系統(tǒng)中，在 UniVessel?SU中，傳感器貼片位于一次性容器的底部，可直接通過自由空間光電子對傳感器進(jìn)行讀數(shù)。

1.2.7 基因表達(dá)定量分析 以龍眼愈傷組織作為材料，采用TriPure Isolation Reagent（Roche）按操作說明書進(jìn)行龍眼愈傷組織總RNA的提取。所獲得的總RNA采用1.0%非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進(jìn)行完整性、純度和濃度的檢測。檢測質(zhì)量合格的總RNA放置于-80 ℃超低溫冰箱保存，待后續(xù)使用。采用PrimerscriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于qPCR。參考Lin等[19]建立的方法，以龍眼EF-1a、elF-4a和DlFSD1a作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量計算。采用SYBR? Premix Ex Taq? II （TliRNaseH Plus； Takara， Japan）在LightCycler480定量儀上進(jìn)行龍眼細(xì)胞表達(dá)模式的分析。龍眼基因qPCR引物序列見表2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS V19.0 軟件，單因素方差分析采用Duncan法，顯著性水平設(shè)為p<0.05。制圖采用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 攪拌式生物反應(yīng)器

龍眼細(xì)胞在一個5 L的攪拌式生物反應(yīng)器（Biostat? B， Sartorius Stedim Biotech）中進(jìn)行，主要由1個5 L的雙壁容器（UniVessel?）、1個控制系統(tǒng)（BioPAT? MFCS SCADA）、1個冷水機(jī)（LF-30）、1個空氣發(fā)生器（東方匯利PGA-10L）組成（圖1）。內(nèi)有靈敏度較高的pH計、溶氧電極、溫度探測計可實(shí)時輸出反應(yīng)器的pH、溶氧、溫度。帶環(huán)形分布器的分布管和帶微孔分布器的分布管實(shí)現(xiàn)密集通氣功能。三葉扇形攪拌器（直徑70 mm）實(shí)現(xiàn)攪拌功能。該生物反應(yīng)器配置配套的在線控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的溫度、攪拌速度、通氣量等參數(shù)的控制。通過BioPAT? MFCS 4軟件對生物反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。

2.2 龍眼不同組織部位的類黃酮含量差異

類黃酮是龍眼中最為重要的次生代謝產(chǎn)物之一。通過對龍眼不同組織部位中類黃酮的含量進(jìn)行對比，結(jié)果見圖2，龍眼果殼的類黃酮含量最高（49.07 mg/g），而果肉的含量較低（16.42 mg/g）。龍眼愈傷組織類黃酮含量明顯低于不同組織部位，但是通過生物反應(yīng)器的放大培養(yǎng)，其類黃酮的產(chǎn)量、效益、周期均優(yōu)于不同組織部位。同時，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)藍(lán)光培養(yǎng)下的龍眼愈傷組織類黃酮含量高于黑暗培養(yǎng)。

2.3 藍(lán)光對龍眼懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長量和類黃酮含量的影響

在攪拌式生物反應(yīng)器中，龍眼懸浮細(xì)胞分別在黑暗和藍(lán)光條件下培養(yǎng)9d，其生長量的變化趨勢見圖3。黑暗培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過3d的延遲期，從第3～7天處于對數(shù)生長期，第7天開始基本進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長緩慢。以同樣的接種濃度，藍(lán)光培養(yǎng)下細(xì)胞的延遲期、生長期、平臺期與黑暗培養(yǎng)較為一致。其中，藍(lán)光培養(yǎng)的細(xì)胞生長率最高出現(xiàn)在第4～5天，而黑暗培養(yǎng)出現(xiàn)在第3～4天。藍(lán)光培養(yǎng)下細(xì)胞生長量從第5天開始略微高于黑暗培養(yǎng)。因此，可推測藍(lán)光對龍眼細(xì)胞的生長量有著微弱的促進(jìn)作用。

在生物反應(yīng)器中，黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)下龍眼細(xì)胞合成類黃酮的情況見圖4。黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，龍眼細(xì)胞類黃酮含量都得到了提升。黑暗條件下，第1～6天類黃酮含量增長緩慢，從第6天開始合成率小幅提升，第9天達(dá)到最高值3.33 mg/g。藍(lán)光條件下，第1～4天類黃酮含量增長緩慢，從第4天開始類黃酮合成率大幅提升，第9天達(dá)到最高值4.10 mg/g。生物反應(yīng)器中，藍(lán)光較之黑暗培養(yǎng)，龍眼細(xì)胞干重增長0.28 g/L，類黃酮含量增長0.77 mg/g。因此，盡管藍(lán)光對龍眼細(xì)胞生長量有著微弱得促進(jìn)作用，但對類黃酮的積累起到明顯的促進(jìn)作用。

2.4 藍(lán)光對龍眼懸浮培養(yǎng)細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力是衡量細(xì)胞在適宜環(huán)境中生長和分裂的能力，通常細(xì)胞活力與離子不可滲透的細(xì)胞膜的存在有關(guān)[20]。通過TTC法測定龍眼懸浮細(xì)胞中的酶活性，可直接反應(yīng)細(xì)胞的活力，即細(xì)胞活力越小，則A值越低[15]。在黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)中，龍眼細(xì)胞的細(xì)胞活力變化較為一致（圖5）。黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，龍眼細(xì)胞的活力變化，這或許就是藍(lán)光對龍眼細(xì)胞生長量不顯著的原因所在。黑暗培養(yǎng)條件下，第1～3天細(xì)胞活力值呈現(xiàn)下降趨勢，第3天為培養(yǎng)過程中的最低值0.271。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)的初期龍眼細(xì)胞需要一個調(diào)整適應(yīng)環(huán)境的過程。第3～6天細(xì)胞活力呈現(xiàn)上升趨勢，至第6天細(xì)胞活力值為0.415，此后又開始下降。第6天以后細(xì)胞活力下降的原因可能是龍眼細(xì)胞生長量達(dá)到平臺期，培養(yǎng)液底物消耗殆盡，不足以提供此階段龍眼細(xì)胞的生長需要。

2.5 藍(lán)光對龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液底物消耗量的影響

蔗糖是植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中最為常用的一種碳源。關(guān)于玫瑰茄懸浮細(xì)胞的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蔗糖是其細(xì)胞生長中最適合的碳源[21]。黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液的蔗糖含量變化情況見圖6。在黑暗培養(yǎng)過程中，第1～5天蔗糖含量呈現(xiàn)大幅下降的趨勢，第5～9天蔗糖含量維持在2 g/L左右。第1～5天蔗糖含量大幅下降，可能是因?yàn)辇堁奂?xì)胞培養(yǎng)前期需要攝取大量的蔗糖。而在藍(lán)光培養(yǎng)過程中，第1～6天蔗糖含量呈現(xiàn)大幅下降趨勢，此后也維持在2 g/L左右。其中，細(xì)胞培養(yǎng)的前期藍(lán)光的蔗糖消耗速度慢于黑暗培養(yǎng)，可能是藍(lán)光生長量略高于黑暗培養(yǎng)的原因所在。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15]報道當(dāng)植物細(xì)胞的狀態(tài)較差，將加快蔗糖水解產(chǎn)能作為一種防御措施，因此黑暗培養(yǎng)的蔗糖消化率較快。另外，還發(fā)現(xiàn)蔗糖的消耗量和龍眼細(xì)胞類黃酮合成量呈反比。

還原糖也是植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中最為常用的一種碳源。黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液的還原糖含量變化情況見圖7。在黑暗培養(yǎng)過程中，第1～4天還原糖呈現(xiàn)上升趨勢，在第4天達(dá)到最高值16.29 g/L；第4～9天還原糖呈現(xiàn)下降趨勢。龍眼細(xì)胞培養(yǎng)的初期，由于部分蔗糖分解成還原糖，還原糖大幅提升。此后為提供細(xì)胞生長，還原糖開始下降。在藍(lán)光培養(yǎng)過程中，第1～5天還原糖呈現(xiàn)上升趨勢，此后下降。其中，黑暗培養(yǎng)的還原糖含量均高于藍(lán)光培養(yǎng)，這可能是因?yàn)橄啾人{(lán)光培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)過程中有更多的蔗糖分解成還原糖，而藍(lán)光中的蔗糖更多的提供于龍眼細(xì)胞的生長。

磷酸鹽也是植物細(xì)胞培養(yǎng)不可或缺的原料之一[22]。在黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液的磷酸鹽含量變化情況見圖8。黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)中磷酸鹽下降的趨勢較為一致。同時，還發(fā)現(xiàn)磷酸鹽消耗量與龍眼細(xì)胞生長量、類黃酮合成量呈反比，并且藍(lán)光磷酸鹽的消耗量大于黑暗培養(yǎng)。這可能是藍(lán)光細(xì)胞生長量略高于黑暗培養(yǎng)，藍(lán)光類黃酮含量顯著高于黑暗培養(yǎng)的原因所在。

2.6 藍(lán)光對龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH的影響

在植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，pH通常在起始階段出現(xiàn)下降，延滯期結(jié)束時開始回升[15， 23]。如圖9所示，黑暗培養(yǎng)過程中，第1～3天培養(yǎng)液pH下降至4.95，至第6天回調(diào)至5.92，此后略微下降。而藍(lán)光培養(yǎng)過程中，第1～3天培養(yǎng)液pH下降至5.13，至第6天回調(diào)至5.88，第6～9天 pH也略微下降。第1～5天，藍(lán)光pH明顯高于黑暗培養(yǎng)，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)初期龍眼細(xì)胞狀態(tài)較差，而藍(lán)光具有修復(fù)細(xì)胞功能[24]，阻斷了部分破碎細(xì)胞內(nèi)含物外泄。

2.7 藍(lán)光對龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液PO2的影響

在黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液PO2的變化趨勢較為一致（圖10）。第1～4天黑暗和藍(lán)光的 PO2分別提升至118.6%、130.5%，第4～9天呈下降的趨勢，而第7～9天基本維持在80%。第1～4天PO2迅速提升，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)初期聚合的龍眼懸浮細(xì)胞不斷被生物反應(yīng)器攪拌松散，培養(yǎng)液中的氧氣得到回升。第4～9天呈下降的趨勢，可能是因?yàn)辇堁奂?xì)胞不斷增長消耗了培養(yǎng)液中的氧氣。

2.8 龍眼懸浮細(xì)胞在藍(lán)光處理下的類黃酮合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化

本研究以黑暗為對照，采用熒光定量PCR檢測在藍(lán)光處理下的龍眼細(xì)胞類黃酮代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化（圖11）。在黑暗培養(yǎng)過程中，DlHY5與DlPAP1的表達(dá)量呈現(xiàn)相同的變化趨勢。而第1～9天，DlCHS的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，第9天達(dá)到最高值0.942。但并未發(fā)現(xiàn)3個基因之間有明顯的聯(lián)系。這可能是因?yàn)楹诎禇l件并不能激發(fā)DlHY5的表達(dá)，DlHY5失活使得類黃酮合成基因不能表達(dá)[6]。而DlCHS的表達(dá)量緩慢上升，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時長也能夠影響類黃酮的積累。在藍(lán)光培養(yǎng)過程中，第1～9天，DlHY5、DlPAP1、DlCHS的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢，第5天后表達(dá)量均顯著提升，3個基因表達(dá)趨勢基本一致。因此，推測藍(lán)光可能通過光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5調(diào)控DlPAP1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控龍眼類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因DlCHS的表達(dá)，導(dǎo)致類黃酮的積累，這種調(diào)控機(jī)制有待遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 討論

3.1 藍(lán)光促進(jìn)龍眼懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長及類黃酮的合成

龍眼細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)中，影響生物反應(yīng)器培養(yǎng)的主要因素為化學(xué)微環(huán)境、氣體微環(huán)境及光照微環(huán)境等[25]。其中，通過光照影響龍眼細(xì)胞培養(yǎng)是一種較為簡便且有效的調(diào)控手段[26]。在生物反應(yīng)器培養(yǎng)龍眼細(xì)胞過程中，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可促進(jìn)龍眼細(xì)胞的生長和類黃酮的合成。王娟等[27]的研究發(fā)現(xiàn)光照條件對西洋參懸浮細(xì)胞生長、人參皂苷及西洋參多糖合成有顯著影響。王璟[7]在貫葉連翹懸浮細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)中，也發(fā)現(xiàn)光照可提升懸浮細(xì)胞生長量和類黃酮含量。在龍眼細(xì)胞培養(yǎng)液底物消耗量的測定中，藍(lán)光培養(yǎng)的還原糖、磷酸鹽消耗量大于黑暗培養(yǎng)；在龍眼細(xì)胞活力測定中，藍(lán)光培養(yǎng)的細(xì)胞活力略高于黑暗培養(yǎng)。這些也從側(cè)面解釋藍(lán)光對龍眼細(xì)胞生長及類黃酮合成的促進(jìn)作用。目前國內(nèi)外多數(shù)研究停留在光照對搖瓶培養(yǎng)植物細(xì)胞的影響，而本研究通過生物反應(yīng)器的培養(yǎng)，實(shí)時統(tǒng)計觀察細(xì)胞活力、底物消耗量、pH、PO2等多項(xiàng)參數(shù)，從而建立培養(yǎng)參數(shù)之間的聯(lián)系，更為直觀地獲取到光照對龍眼細(xì)胞培養(yǎng)的差異。因此，藍(lán)光可能加速了龍眼細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)（還原糖、磷酸鹽）等的吸收，提升了細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞分化生長，進(jìn)而促進(jìn)了類黃酮的代謝合成。

3.2 蔗糖、還原糖、磷酸鹽是影響龍眼懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和類黃酮含量的主要因素

在生物反應(yīng)器培養(yǎng)龍眼細(xì)胞的進(jìn)程中，蔗糖、還原糖、磷酸鹽逐漸被消耗，這些都為龍眼細(xì)胞增殖提供原料[28]。前人的研究中已經(jīng)表明糖是植物體內(nèi)重要組成成分，不僅為植物生長提供能量，也為植物次生代謝產(chǎn)物的合成提供原料[29-30]。在柑橘愈傷組織的研究中發(fā)現(xiàn)，糖可能是愈傷組織積累類胡蘿卜素的信號因子[31]。蔗糖能夠調(diào)節(jié)擬南芥PAP1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而增加花青素合成基因的表達(dá)，進(jìn)而影響花青素的合成[32]。另外，在擬南芥研究中已經(jīng)表明光信號和糖信號能夠協(xié)同調(diào)控植物的生長和代謝[33]。生物反應(yīng)器可保證植物細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的一致性，培養(yǎng)細(xì)胞的均一性，這些將為今后光信號和糖信號協(xié)同作用的研究提供優(yōu)良的基礎(chǔ)。磷酸鹽也是植物細(xì)胞培養(yǎng)不可或缺的原料之一[22]。在關(guān)于黃連懸浮細(xì)胞的研究中就發(fā)現(xiàn)P元素的消耗較快，并且與細(xì)胞生長和次生產(chǎn)物的合成有密切聯(lián)系[34]。王靜等[35]的研究中也已經(jīng)表明磷元素對桔梗的多糖有著顯著的促進(jìn)作用。

通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)龍眼細(xì)胞，更為明確地了解到細(xì)胞生長過程中，每個階段消耗蔗糖、還原糖、磷酸鹽的情況。通過這些培養(yǎng)特征的研究，將為后續(xù)研究起到提示作用。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子DlHY5、DlPAP1參與藍(lán)光調(diào)控龍眼懸浮培養(yǎng)細(xì)胞類黃酮的積累

光照可通過植物體內(nèi)的光受體感知，并通過光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的合成[36]。HY5作為光形態(tài)建成的正調(diào)控因子，是光調(diào)控植物生長發(fā)育、代謝合成等的分子開關(guān)[37]。在擬南芥和蘋果的研究中已經(jīng)表明，光照通過HY5激活R2R3 MYBs，進(jìn)而調(diào)控類黃酮結(jié)構(gòu)基因，最終達(dá)到調(diào)控類黃酮的積累[38-40]。在Li等[41]的研究也表明光照促使HY5表達(dá)量提高，同時類黃酮途徑基因表達(dá)量也很快出現(xiàn)變化。本研究發(fā)現(xiàn)龍眼細(xì)胞培養(yǎng)過程中，藍(lán)光的DlHY5表達(dá)量與類黃酮含量趨勢呈正相關(guān)，而黑暗培養(yǎng)的DlHY5與類黃酮含量無明顯規(guī)律，說明藍(lán)光可通過光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5調(diào)控龍眼細(xì)胞類黃酮的合成。

相關(guān)研究已闡述了藍(lán)光調(diào)控類黃酮的途徑，藍(lán)光作用下，COP1/SPA1 （Suppressor of phya-105）復(fù)合體激活了光感受器CRY，導(dǎo)致COP1（constitutively photomorphogenic 1）蛋白脫離結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，離開細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄因子HY5活化，促進(jìn)了光調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)控類黃酮的積累[6]。

擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)HY5可誘導(dǎo)類黃酮的合成轉(zhuǎn)錄因子PAP1的表達(dá)[9]。本研究中龍眼的DlPAP1與DlHY5的表達(dá)規(guī)律基本一致，說明藍(lán)光通過光信號轉(zhuǎn)錄因子DlHY5調(diào)控DlPAP1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控龍眼類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因DlCHS的表達(dá)，導(dǎo)致類黃酮的積累。關(guān)于這種調(diào)控機(jī)制有待遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用5L生物反應(yīng)器對龍眼細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)，對黑暗和藍(lán)光處理下龍眼細(xì)胞的培養(yǎng)特征進(jìn)行研究，將為今后龍眼細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)類黃酮奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Sudjaroen Y，Hull W E，Erben G，et al. Isolation and characterization of ellagitannins as the major polyphenolic components of Longan （Dimocarpus longan Lour） seeds[J]. Phytochemistry，2012，77：226-237.

[2] Santos-Buelga C. Flavonoids：Functions，Metabolism and Biotechnology[M]. Weinheim：Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，2016.

[3] Xu J，Ge X，Dolan M C. Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures[J]. Biotechnology Advances，2011，29（3）：278-299.

[4] 李麗琴. 紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇的分子調(diào)控機(jī)理[D]. 武漢：華中科技大學(xué)，2009.

[5] 葛 鋒，王劍平，王曉東，等. 新疆紫草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（3）：460-465.

[6] Zoratti L，Karppinen K，Escobar AL，et al. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5（5）：534.

[7] 王 璟. 貫葉連翹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的研究[M]. 上海：華東理工大學(xué)， 2015.

[8] 鐘春水，賴瑞聯(lián)，劉生財，等. 光源或培養(yǎng)基成分對金花茶愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因表達(dá)及總兒茶素含量的影響[J]. 廣西植物，2016，36（12）：1 410-1 415.

[9] Dong H S，Choi M G，Kim K，et al. HY5 regulates anthocyanin biosynthesis by inducing the transcriptional activation of the MYB75/PAP1 transcription factor in Arabidopsis[J]. Febs Letters，2013，587（10）：1 543-1 547.

[10] Takayuki T，Mutsumi W，Rainer H，et al. Shikimate and phenylalanine biosynthesis in the green lineage[J]. Frontiers in Plant Science，2013，4（1）：62.

[11] 董慧雪，周燕蓉，田奇琳，等. 不同光質(zhì)對龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報，2014，35（12）：2374-2377.

[12] 賴鐘雄，陳振光. 龍眼胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生植株[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2002，8（3）：485-491.

[13] 賴鐘雄，潘良鎮(zhèn)，陳振光. 龍眼胚性細(xì)胞系的建立與保持[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然版），1997（2）：160-167.

[14] 李 琨，張學(xué)杰，張德純，等. 不同芹菜品種葉與葉柄黃酮含量及其與抗氧化能力的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報，2011，38（1）：69-76.

[15] 張建文，劉 禹，夏建業(yè)，等. 機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器的CFD模擬及剪切力對紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，42（3）：492-498.

[16] 單會嬌，王 冰. 龍葵藥材中可溶性糖的動態(tài)積累[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：100-102.

[17] 趙 凱，許鵬舉，谷廣燁. 3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（3）：534-536.

[18] 李永遠(yuǎn)，楊坤朋. 水中總磷酸鹽（Phosphate salt）的測定方法[J]. 中國化工貿(mào)易，2013（3）：212.

[19] Lin Y L，Lai Z X. Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J]. Plant Science，2010，178（2）：359-365.

[20] Meijer J J，Hoopen H J G T，Luyben K C A M，et al. Effects of hydrodynamic stress on cultured plant cells：A literature survey[J]. Enzyme & Microbial Technology，1993，15（3）：234-238.

[21] 侯學(xué)文，郭 勇. 不同碳源對懸浮培養(yǎng)玫瑰茄細(xì)胞呼吸強(qiáng)度及產(chǎn)生輔酶Q的影響[J]. 廣西植物，1999，19（1）：150-153.

[22] Pratt J，Boisson A M，Gout E，et al. Phosphate （Pi） starvation effect on the cytosolic Pi concentration and Pi exchanges across the tonoplast in plant cells：an in vivo 31P-nuclear magnetic resonance study using methylphosphonate as a Pi analog[J]. Plant Physiology，2009，151（3）：1 646-1 657.

[23] 李雅麗，孟婷婷，王毛毛，等. 甘草細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)[J]. 植物生理學(xué)報，2015（3）：302-306.

[24] Yu X，Liu H，Klejnot J，et al. The CRY blue light receptors[J]. Arabidopsis Book，2010，8：e0135.

[25] 于 丹，樸炫春，李 陽，等. 利用生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)東北刺人參不定根的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（16）：252-255.

[26] 高慧君. 利用柑橘愈傷組織研究植物類胡蘿卜素積累的調(diào)控機(jī)理[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[27] 王 娟，高文遠(yuǎn)，黃 滔，等. 培養(yǎng)條件對西洋參懸浮細(xì)胞生物量和活性成分的影響[J]. 中國中藥雜志，2009，34（4）：375-378.

[28] Dan Q U，Wang H M，Ren J. Effects of sugar content on cell growth， accumulation of rosemary acid， and antioxidative enzyme activity in suspension cells of rosemary[J]. Bulletin of Botanical Research，2015.

[29] Hummel M，Rahmani F，Smeekens S，et al. Sucrose-mediated translational control[J]. Annals of Botany，2009，104（1）：1-7.

[30] Zheng Y，Li T，Liu H，et al. Sugars induce anthocyanin accumulation and flavanone 3-hydroxylase expression in grape berries[J]. Plant Growth Regulation，2009，58（3）：251-260.

[31] Price J，Laxmi A，St Martin SK，et al. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2004，16（8）：2 128-2 150.

[32] Solfanelli C，Perata P. Sucrose-specific induction of the anthocyanin biosynthetic pathway in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2006，140（2）：637.

[33] 劉忠娟. PIFs在糖調(diào)節(jié)植物生長代謝中的作用機(jī)理研究[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)， 2011.

[34] 程 華，余龍江. 不同因素對巖黃連懸浮細(xì)胞生長的影響[J]. 生物技術(shù)，2007，17（3）：56-59.

[35] 王 靜，王渭玲，徐福利，等. 氮磷鉀對桔梗生長及次生代謝產(chǎn)物的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2012，29（4）：586-591.

[36] Jiao Y，Lau O S，Deng XW. Light-regulated transcriptional networks in higher plants[J]. Nature Reviews Genetics，2007，8（3）：217-230.

[37] Lee J，He K，Stolc V，et al. Analysis of transcriptional factor HY5 genomic binding sites revealed its hierarchical role in light regulation of development[J]. Plant Cell，2007，19（4）：731-749.

[38] Stracke R，F(xiàn)avory J J，Gruber H，et al. The Arabidopsis bZIP transcription factor HY5 regulates expression of the PFG1/MYB12 gene in response to light and ultraviolet-B radiation[J]. Plant Cell & Environment，2010，33（1）：88.

[39] Maier A，Schrader A，Kokkelink L，et al. Light and the E3 ubiquitin ligase COP1/SPA control the protein stability of the MYB transcription factors PAP1 and PAP2 involved in anthocyanin accumulation in Arabidopsis[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2013，74（4）：638-651.

[40] Peng T，Saito T，Honda C，et al. Screening of UV-B-induced genes from apple peels by SSH：possible involvement of MdCOP1-mediated signaling cascade genes in anthocyanin accumulation[J]. Physiologia Plantarum，2013，148（3）：432-444.

[41] Li J，Li G，Gao S，et al. Arabidopsis transcription factor ELONGATED HYPOCOTYL5 plays a role in the feedback regulation of phytochrome A signaling[J]. Plant Cell，2010，22（11）：3 634-3 649.