嚴(yán)佳文 肖圖艦 袁啟鳳 解璞 彭志軍 毛永亞 馬玉華

摘 要 為深入挖掘火龍果SSR和SNP分子標(biāo)記，以自交親和型火龍果新種質(zhì)‘黔蜜龍轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)，系統(tǒng)分析了SSR和SNP位點(diǎn)多態(tài)性和分布特征。轉(zhuǎn)錄組序列組裝共獲得96 800個(gè)unigene，其中28 471個(gè)unigene在數(shù)據(jù)庫中得到注釋，在各個(gè)數(shù)據(jù)庫中均得到注釋的有5 800個(gè)。從unigene中搜尋到26 167個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為0.35個(gè)/kb。SSR重復(fù)類型共180種，單核苷酸重復(fù)最多（66.00%），其次為二核苷酸重復(fù)（23.01%）、三核苷酸重復(fù)（9.99%），其他類型較少（1.00%）。SSR長度在10～381 bp，10～11 bp的SSR有7 988條（30.53%），長度12～20 bp的有15 901條（60.77%），長度21～40 bp的有1373條（5.25%），長度大于40 bp的有905條（3.46%）。unigene中共有357 330個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)生頻率為1/204 bp，其中堿基轉(zhuǎn)換位點(diǎn)226 165個(gè)（63.29%），堿基顛換位點(diǎn)141 165個(gè)（36.71%）。6種單堿基變異類型中，C/T、A/G的發(fā)生頻率最高，分別占31.91%和30.38%。A/T、A/C、T/G和C/G這4種顛換類型分別占SNP總數(shù)的7.85%、7.85%、7.2%和13.09%。，堿基轉(zhuǎn)換類型比例顯著高于顛換類型。火龍果轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR和SNP位點(diǎn)豐富，篩選多態(tài)性、準(zhǔn)確率高的引物，有望在火龍果遺傳多樣性分析、品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 火龍果；轉(zhuǎn)錄組；SSR；SNP

中圖分類號 S667.9；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Simple sequence repeat （SSR） and single nucleotide polymorphism （SNP） loci were searched and analyzed based on the transcriptomic data of Qianmilong， a pitaya variety （self-compatible）. A total of 96 800 unigenes were detected， of which 29.95% were annotated according to databases. And 26 167 SSR loci occurred in the unigenes were identified， with the frequency of 0.35/kb， including 180 SSR repeat motifs. The mononucleotide repeats were the most abundant SSR type with a frequency of 66.00%， followed by dinuclotide repeat （23.01%） and trinucleotide repeat （9.99%）， respectively. The length of the SSR was between 10 bp and 381 bp. There were 7 988， 15 901 and 1 373 SSRs with the length between 10～11 bp， 12～20 bp and 21～40 bp， respectively. Only 905 SSRs with the length more than 40 bp. A total of 357 330 SNPs were identified in 96 800 unigenes， with the frequency of 1/204 bp. The transition type of SNPs were 226 165， with the proportion of 63.29%， while the transversion type were 141 165， with the proportion of 36.71%. The number of the transition type was higher than that of the transversion type significantly. The C/T and A/G belonging to the transition type occurred most frequently among six kind of SNP types with the proportion of 31.91% and 30.38%， respectively. The SSR and SNP loci in the sequence of the pitaya transcriptome are abundant. The primers with high polymorphic by screening based on the present study would be applied to the genetic diversity analysis， variety identification and genetic map construction of pitaya in the further research.

Keywords pPitaya； Hylocereus undatus Britt. ； transcriptome； SSR； SNP

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.076.001012

火龍果（Hylocereus spp.）原產(chǎn)于墨西哥等中美洲地區(qū)，是一種典型的熱帶水果[1]。我國大陸地區(qū)于20世紀(jì)90年代開始引種試種火龍果，如今已在廣西、貴州、廣東和海南等多個(gè)南方省份廣泛種植，產(chǎn)生了重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[2-3]。國內(nèi)火龍果品種資源超過200份，同物異名現(xiàn)象普遍，鑒定和分類工作尚未形成完善的體系[4]，這在一定程度上限制了資源利用和育種工作的開展。

分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于果樹品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等[5-6]，在火龍果種質(zhì)資源相關(guān)研究方面也取得了一定的進(jìn)展。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA， RAPD）標(biāo)記可以區(qū)分紅肉和白肉火龍果類型[7]。簡單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat， ISSR）標(biāo)記技術(shù)也已成功應(yīng)用于貴州、福建等地的火龍果遺傳多樣性評價(jià)和種質(zhì)鑒定[8-10]。以上2種分子標(biāo)記技術(shù)存在一定的局限性，RAPD技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，ISSR標(biāo)記對體細(xì)胞遺傳變異的檢測效率較低[11]。近年來，簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat， SSR）標(biāo)記[3]和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）標(biāo)記[1]也開始應(yīng)用于火龍果相關(guān)研究。這兩類分子標(biāo)記特異性更強(qiáng)，但目前可用于火龍果遺傳多樣性分析等相關(guān)研究的引物數(shù)量有限，還需開發(fā)更多SSR和SNP分子標(biāo)記，以促進(jìn)此類研究的深入。

轉(zhuǎn)錄組測序是開發(fā)SSR和SNP分子標(biāo)記的有效策略，在柑橘[甜橙（Citrus sinensis）、枳橙（Poncirus trifoliata×Citrus sinensis）][12]、桃（prunus persica）[13]、枇杷[14]、獼猴桃（Actinidia chinensis）[145]、梨（Pyrus spp.）[1615-1716]、枇杷（Eriobotrva japonica）[17]、李（Prunus salicina）[18]、中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）[19]、柿（Diospyros kaki）[20]等果樹上均得到成功應(yīng)用，而火龍果上尚未見相關(guān)研究報(bào)道?；谵D(zhuǎn)錄組序列的分子標(biāo)記信息量大、通用性好，在親緣物種之間校正連鎖圖譜和比較作圖方面有很高的利用價(jià)值。此外，SNP還有覆蓋率高、檢測方法多樣等優(yōu)勢[21]。本研究以自交親和型火龍果新種質(zhì)‘黔蜜龍為試材，應(yīng)用Illumina Hiseq測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)組裝，全面挖掘火龍果的SSR和SNP信息，系統(tǒng)分析了其分布規(guī)律和特征，以期為火龍果新型分子標(biāo)記的開發(fā)提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)，為高效引物的篩選提供序列參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自農(nóng)業(yè)部火龍果種質(zhì)資源保護(hù)貴州創(chuàng)新基地（25°21′18′′～25°21′27′′N，105°46′14′′～ 105°46′36′′E）。選取樹齡3三年，長勢好一致、無病蟲害的紅肉型‘黔蜜龍火龍果新種質(zhì)‘黔蜜龍（H. polyrhizusundatus Britt.）為實(shí)驗(yàn)材料，分別采集未分化期、分化初期和花器官形成階段的花芽組織各3份，液氮速凍后保存于–80 ℃超低溫冰箱，備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取芽組織總RNA，Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent 2100測定RIN值。選取條帶清晰，無色素、蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)污染，RIN值≥7.0、OD260/280≥1.8、OD260/230≥1.5、濃度≥50 ng/μL的符合轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?yàn)要求的RNA用于文庫構(gòu)建。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝和注釋 經(jīng)檢測合格的總RNA樣品先進(jìn)行mRNA富集，然后隨機(jī)打斷成300 bp左右的小片段。以這些小片段mRNA為模版合成第一鏈cDNA，隨后在DNA聚合酶I和核糖核酸酶H的作用下合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA純化、補(bǔ)成平末端并連接測序接頭。采用PCR技術(shù)富集文庫，以膠回收試劑盒純化目的片段?；厥债a(chǎn)物以TBS-380微型熒光計(jì)進(jìn)行定量。最后應(yīng)用橋式PCR擴(kuò)增獲得最終的測序文庫，經(jīng)檢測合格后即可進(jìn)行Illumina Hiseq測序。測序完成后，先去掉所有樣品原始數(shù)據(jù)中含有接頭以及質(zhì)量較低的Reads，得到的Clean reads以Trinity軟件進(jìn)行混合拼接，組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列。選取每個(gè)基因最長的轉(zhuǎn)錄本序列，應(yīng)用BlastX軟件與Pfam、String、KEGG、Swissprot、NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得與數(shù)據(jù)庫匹配的unigene的注釋信息。未能與數(shù)據(jù)庫匹配的unigene，應(yīng)用ESTScan軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測，進(jìn)而確定核酸序列及其所編碼的氨基酸的注釋信息。

1.2.3 SSR和SNP分析方法 應(yīng)用MISA軟件（microsatellite searching tool）搜索unigene的SSR位點(diǎn)，最短重復(fù)次數(shù)的參數(shù)設(shè)置為：單堿基10次，二堿基6次，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基均為5次。應(yīng)用SAM（samtools Sequence Alignment/Map）和VarScan軟件（variant detection in massively parallel sequencing data），將組裝好的轉(zhuǎn)錄本序列與原始序列進(jìn)行比對，搜索候選SNP。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

各樣品總RNA濃度為200～401 ng/μL，總量7.8～16.04 μg，OD260/280為2.15～2.19，OD260/230為1.50～2.29，RIN值為7.0～9.5。各項(xiàng)指標(biāo)均符合測序要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 測序與序列組裝

轉(zhuǎn)錄組測序共獲得130 996條transcript序列，其平均長度為969.54 bp，GC含量為50.32%，Q30值為96.33%。經(jīng)過組裝和去冗余處理后，得到96 800個(gè)unigene，其平均長度為773.40 bp，N50為1 302 bp，總長度為74 865 467 bp，長度集中范圍為201～1 000 bp（圖1A1-a）。其中，長度為201～400 bp的序列有45 296條，占總數(shù)的46.79%；401～600 bp的序列有16 173條（16.71%），601～800 bp的序列有8 796條（9.09%），801～1 000 bp的序列有5 439條（5.62%）（圖1-Bb）。

SSR的長度和重復(fù)次數(shù)是影響其多態(tài)性的重要因素。SSR大于等于20 bp時(shí)，多態(tài)性較高；長度在12～20 bp的SSR，多態(tài)性中等；長度在12 bp以下的SSR，多態(tài)性極低[24]。本研究中，SSR長度變化范圍為10～381 bp，長度大于20 bp的SSR有2 278個(gè)，占總數(shù)的8.71%。此類SSR位點(diǎn)可能具有高度多態(tài)性，應(yīng)作為火龍果SSR分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)的首選。

SNP分子標(biāo)記覆蓋率極高，可用于果樹品種鑒定、功能基因精細(xì)定位等。本研究從‘黔蜜龍火龍果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索到了357 330個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)生頻率為1/204 bp，高于梨（1/344 bp）[15]、柿（1/253 bp）[20]和蘋果（1/288 bp）[25]，低于葡萄（1/64bp）[26]。由此可見，‘黔蜜龍火龍果SNP發(fā)生頻率中等。這種SNP頻率差異出現(xiàn)的原因，除了與物種間的遺傳背景差異有關(guān)外，還可能與SNP檢測方法以及檢測軟件參數(shù)設(shè)置差異相關(guān)。6種單堿基變異類型中，C/T、A/G的發(fā)生頻率最高，分別占SNP位點(diǎn)總數(shù)的31.91%和31.38%，堿基轉(zhuǎn)換類型比例顯著高于顛換類型。這與梨（31.50%，31.66%）[15]、柿（31.51%，31.41%）[20]等果樹中的研究結(jié)果一致。而C/T類型發(fā)生頻率之所以最高，可能是因?yàn)镾NP在CG序列上出現(xiàn)得最為頻繁，而C常以甲基化形式存在，脫氨后即成為T[27]。

本研究應(yīng)用Illumina Hiseq測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)組裝，充分挖掘火龍果SSR和SNP位點(diǎn)，并對其多態(tài)性特征進(jìn)行了全面分析，為火龍果SSR和SNP分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。通過后續(xù)研究，設(shè)計(jì)、篩選多態(tài)性和準(zhǔn)確率較高的引物，有望在火龍果遺傳多樣性分析、品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 俞 超， 陳 煜， 汪財(cái)生， 等. 基于SLAF-seq技術(shù)的紅心火龍果SNP位點(diǎn)開發(fā)及遺傳分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（4）： 591-596.

[2] 蔡永強(qiáng)， 向青云， 陳家龍， 等. 火龍果的營養(yǎng)成分分析[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 2008， 26（4）： 53-56.

[3] Pan L M， Fu XJ， Zhang R， et al. Genetic diversity among germplasms of Pitaya based on SSR markers[J]. Scientia Horticulturae， 2017， 225： 171-176.

[4] 李洪立， 胡文斌， 洪青梅， 等. 30份火龍果種質(zhì)資源收集保存與初步鑒定評價(jià)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（11）： 2 034-2 039.

[5] 李貝貝， 劉崇懷， 姜建福， 等. 葡萄品種分子鑒定研究進(jìn)展及展望[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（15）： 15-20.

[6] 魯振華， 牛 良， 張南南， 等. 基于SNP標(biāo)記的桃矮化基因精細(xì)定位[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 50（18）： 3 572-3 580.

[7] 李加強(qiáng). 火龍果實(shí)生群體主要性狀遺傳規(guī)律探討及肉色相關(guān)的RAPD分子標(biāo)記篩選[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[8] 張冰雪， 范付華， 喬 光， 等. 貴州地方火龍果芽變種質(zhì)DNA指紋圖譜及遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2013， 30（4）： 573-577.

[9] Fan Q J， Zheng S C， Yan F X， et al. An eEfficient regeneration of dragon fruit pitaya （Hylocereus undatus） and an assessment of the genetic fidelity assessment of of in vitro-derived plants using ISSR markers[J]. The Journal of Horticultural Science & Biotechnology， 2013， 88（5）： 631-637.

[10] 陳明賢. 福建省火龍果種質(zhì)資源ISSR分析及耐鹽生理性研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[11] 陳桂信， 潘東明， 呂柳新， 等. DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其在熱帶亞熱帶果樹上的應(yīng)用[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 2002， 24（2）： 176-182.

[12] Jiang D， Zhong G Y， Hong Q B. Analysis of microsatellites in citrus unigenes[J]. Acta Genetica Sinica， 2006， 33（4）： 345-353.

[13] Wang L， Zhao S， Gu C. Deep RNA-Seq uncovers the peach transcritome landscape[J]. Plant Molecular Biology， 2013， 83（4-5）： 365-377.

[14] 孟 蒙， 唐 維， 劉 嘉， 等. 基于中華獼猴桃“紅陽”轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)EST-SSR分子標(biāo)記[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2014， 20（4）： 564-570.

[15] 周 賀， 李浩男， 蔡斌華， 等. 砂梨果皮轉(zhuǎn)錄組SNP位點(diǎn)發(fā)掘及其功能注釋分析[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2014， 31（2）： 105-111.

[16] Yue X Y， Liu G Q， Zong Y， et al. Development of genic SSR markers from transcriptome sequencing of pear buds[J]. Journal of Zhejiang University- SCIENCE B （Biomedicine & Biotechnology）， 2014， 15（4）： 303-312.

[17] 鄭婷婷， 魏偉淋， 楊向暉， 等. 基于枇杷轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2015， 44（4）： 274-278.

[18] 方智振， 葉新福， 周丹蓉， 等.‘芙蓉李轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析與分子標(biāo)記開發(fā)[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2016， 33（4）： 416-424.

[19] 宗 宇， 王 月， 朱友銀， 等. 基于中國櫻桃轉(zhuǎn)錄組的SSR分子標(biāo)記開發(fā)與鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2016， 43（8）： 1 566-1 576.

[20] 杜改改， 孫 鵬， 索玉靜， 等. 基于柿雌雄花芽轉(zhuǎn)錄組測序的SSR和SNP多態(tài)性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 22（10）： 45-55.

[21] 李小白， 向 林， 羅 潔， 等. 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）策略及其數(shù)據(jù)在分子標(biāo)記開發(fā)上的應(yīng)用[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 35（5）： 720-726， 740.

[22] Dong S B， Liu Y L， Niu J， et al. De novo transcriptome analysis of the Siberian apricot （Prunus sibirica L.） and search for potential SSR markers by 454 pyro sequencing[J]. Gene， 2014， 544（2）： 220-227.

[23] Morgante M， Hanafey M， Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes[J]. Nature Genetics， 2002， 30： 194-～200.

[24] Temnykh S， DeCclerk G， Lukashova A， et al. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）： Ffrequency， length variation， transposon associations， and genetic marker potential[J]. Genome Research， 2001， 11（8）： 1 441-1 452.

[25] Chagné D， Crowhurst R N， Troggio M， et al. Genome-wide SNP detection， validation， and development of an 8K SNP array for apple[J]. PLloSs ONEne， 2012， 7（2）： e31745.

[26] Lijavetzky D， Cabezas J A， Ibá?ez A， et al. High throughput SNP discovery and genotyping in grapevine （Vitis vinifera L.） by combining a re-sequencing approach and SNPlex technology[J]. BMC Genomics， 2007， 8： 424.

[27] Brookes A J. The essence of SNPs[J]. Gene， 1999， 234（2）： 177-186.