李鴻鵬 鐘昌開 吳秋玉 張艷杰 張賀

摘? 要? 果膠裂解酶是炭疽菌在侵染寄主過程中降解寄主細(xì)胞壁的一類重要水解酶。本研究在杧果炭疽病菌中克隆獲得了3個果膠裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3，DNA全長分別為1 037、1 498、1 089 bp，cDNA全長分別為975、1 380、978 bp，分別編碼324、459、325個氨基酸，均含1個果膠裂解酶保守結(jié)構(gòu)域，均有典型的信號肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋分別占16.05%、20.26%、16.92%，延伸鏈分別占28.09%、21.79%、29.54%，β-轉(zhuǎn)角分別占5.86%、8.93%、7.38%，無規(guī)則卷曲分別占50.00%、49.02%、46.15%。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的氨基酸序列分別與C.tofieldiae（KZL77240.1）、草莓炭疽菌（C. gloeosporioides）（XP-007274932.1）、C.incanum（KZL84476.1）果膠裂解酶序列相似度在93%以上。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，3個果膠裂解酶基因在整個侵染過程中均持續(xù)高效表達(dá)，但在漆酶基因Lac1敲除突變體中，表達(dá)均下降約90%?？梢?em>Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3是果膠裂解酶基因家族成員，序列差異較大，在侵染過程中起著重要的作用，且其表達(dá)受漆酶基因Lac1影響。

關(guān)鍵詞? 杧果;膠孢炭疽菌;果膠裂解酶基因;漆酶基因Lac1中圖分類號? S432.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.019

杧果（Mangifera indicaL.）是重要的熱帶、亞熱帶果樹，享有“熱帶果王”的盛譽(yù)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值^[1]。杧果炭疽病是杧果生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、為害最嚴(yán)重的一種病害，在世界杧果種植區(qū)內(nèi)廣泛發(fā)生，也是貯藏期的重要病害之一，發(fā)病重的果園減產(chǎn)達(dá)60%～70%，膠孢炭疽菌[Colle?totrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]是其主要致病菌^[2-3]。該病原菌寄主范圍十分廣泛，大多數(shù)熱帶亞熱帶果樹是其重要寄主，還可侵染蔬菜、花卉、中草藥及各種經(jīng)濟(jì)作物^[4]。

炭疽菌主要靠黑色素化附著胞直接侵入寄主，再分泌大量細(xì)胞壁降解酶擴(kuò)展^[5]。DHN黑色素在植物病原真菌中普遍存在，它在附著胞膨壓產(chǎn)生上起著關(guān)鍵的作用，其合成途徑中有多個關(guān)鍵的酶基因，其中漆酶是催化最后一步黑色素合成的酶^[6]。在杧果炭疽病菌中，漆酶Lac1在菌絲的生長、發(fā)育、分化、黑色素的沉著、產(chǎn)孢和漆酶的分泌以及對寄主的致病力等方面起著重要的調(diào)控作用^[7]。

果膠酶是細(xì)胞壁降解酶中的一類，也是分解果膠質(zhì)的酶總稱，按其作用方式和底物類型可分為原果膠酶、果膠酯酶、裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶^[8]。許多病原真菌、細(xì)菌在侵染植物的過程中都可以產(chǎn)生果膠裂解酶（pel），裂解高度酯化的果膠，破壞植物組織的完整性，使薄壁細(xì)胞組織軟化^[9-10]，從而達(dá)到降解植物細(xì)胞壁的效果。Erwinia chrysanthemi strain 3937有5個Pel基因PLa～PLe，其中只有PLa、PLd和PLe對病原菌的致病力有影響，且PLe比PLa和PLd的作用更強(qiáng)，PLe突變后失去了侵染能力^[11]。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的12個候選果膠裂解酶基因中只有Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20能夠明顯影響致病力^[9]。可見果膠裂解酶基因多以基因家族形式存在，同一病菌中不同的果膠裂解酶基因作用存在明顯差異。將杧果炭疽病菌接種至PD培養(yǎng)液，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d的過程中，均能檢測到果膠酶活性^[12]。有關(guān)果膠裂解酶基因的分子特征及其在杧果炭疽病菌侵染寄主過程中的作用尚未見報道。因此本研究擬利用同源克隆技術(shù)，從杧果炭疽病菌（C. gloeosporioides）中克隆pel，分析其在不同侵染時段的表達(dá)情況，及與另一個侵染關(guān)鍵基因漆酶基因Lac1的關(guān)系，為探究果膠裂解酶基因在杧果炭疽病菌致病過程中的作用、揭示杧果炭疽病菌的致病分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料和引物杧果炭疽病菌膠孢炭疽菌[C. gloeosporioides（Penz.）Sacc.] A2菌株由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹課題組提供。臺農(nóng)芒嫩葉采自海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院基地。漆酶基因Lac1敲除突變體由本實(shí)驗(yàn)室提供。本研究所用引物如表1所示。

1.1.2? 主要試劑 ?真菌gDNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購于Omaga公司;RNA提取試劑盒和TIANScript cDNA First-Stand Kit購于TIANG?ENE公司;E. coli DH5α、10× PCR Buffer、dNTPs、TaqDNA酶、2Taq-Mixture、DNA marker DL2000等均購于TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒2xTransStart^? Tip Green qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)科技有限公司，其他試劑均為常規(guī)試劑。

1.2? 方法

1.2.1Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA序列的擴(kuò)增 ?根據(jù)橡膠樹膠孢炭疽菌HBCg01全基因組信息查找果膠裂解酶基因序列，設(shè)計引物A2pel1-F1/R1、5A2pel2-F1/R1、3A2pel2-F1/R1、5A2pel3-F1/R1和3A2pel3-F1/R1（表1），用于擴(kuò)增杧果炭疽病菌3個果膠裂解酶基因DNA序列。PCR體系為50 μL：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，TaqDNA酶1.0 μL，ddH₂O 37 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，Tm 45 s，72 ℃ 2 min，35個

1.2.2Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA的擴(kuò)增? 以杧果炭疽病菌gRNA反轉(zhuǎn)錄后的總cDNA為模板，用引物對Rpel1F1/R1、Rpel2F1/R1、Rpel3F1/R1（表1）擴(kuò)增3個果膠裂解酶基因cDNA序列，其余同1.2.1節(jié)。

1.2.3Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析? 利用DNAssist 1.0軟件比對分析所獲得的Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因DNA和cDNA序列，拼接獲得全長，并找出起始密碼子、終止密碼子、內(nèi)含子、外顯子。用Primer 5.0軟件推測其編碼的氨基酸序列。用ProtParam軟件分析其理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)等。用MEGA 4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。用Singal 3.0軟件分析信號肽位置。用TMHMM軟件分析跨膜區(qū)。用SOPMA軟件分析二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染臺農(nóng)芒嫩葉過程中的表達(dá)分析 ?以SR作為內(nèi)參基因，用擴(kuò)增Rpel1、Rpel2和Rpel3的引物（表1）檢測Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染臺農(nóng)芒嫩葉過程中的相對表達(dá)量。參考張賀等^[13]的方法制備濃度為4×10⁶個/mL的分生孢子懸浮液，用于接種嫩葉。用清水洗凈嫩葉，浸泡于1% NaClO溶液中15 min后，用超純水沖洗3次，置于保鮮盒中，保持RH 100%，用束針刺傷嫩葉后滴加20 ?L孢子懸浮液，28 ℃下恒溫黑暗培養(yǎng)。接種后的取樣時間點(diǎn)為0、6、12、24、36、48、72 h，以0 h的為對照。取樣方法：用直徑為1 cm的打孔器取12個接種點(diǎn)，按照不同的時間點(diǎn)取樣后至于液氮速凍，-80 ℃保存、備用。每組處理重復(fù)3次。

參照Tiangen RNA Kit中的方法提取不同時間點(diǎn)的病原菌總RNA，參照TIANScript cDNA First-Stand Kit試劑盒完成第一鏈cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，備用。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL：ddH₂O 2 μL，cDNA 1 μL，引物各1 μL，2xTransStart^? Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，Rotor-Gene Q型實(shí)時熒光PCR儀檢測。數(shù)據(jù)分析運(yùn)用2^–ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)計算，實(shí)時熒光定量PCR儀系統(tǒng)導(dǎo)出各樣品的C_t值，以接菌0 h的為對照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán);在72 ℃時收集熒光信號。

1.2.5Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突變體的表達(dá)分析? 提取漆酶基因Lac1敲除突變體和野生型A2總RNA，以在野生型A2中的表達(dá)量為對照，以SR作為內(nèi)參基因，分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在漆酶基因Lac1敲除突變體中的相對表達(dá)量。其余參照1.2.4節(jié)。每組處理重復(fù)3次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA片段的擴(kuò)增