袁媛 龐玉新 元超

摘 要 本研究采用硅膠柱層析、ODS反相柱層析、sephadex LH-20分子篩技術分離純化艾納香乙酸乙酯，共獲得7個化合物。采用波譜學技術進行結構鑒定，7個化合物分別為：3，3，5，7-四羥基-4-甲氧基-二氫黃酮（1），7-甲氧基紫衫葉素（padmatin）（2），木犀草素-7-甲醚（3），咖啡酸（4），北美圣草素（5），槲皮素（6）和木犀草素（7）。采用96孔板倍比稀釋法，對單體化合物抗細菌活性進行評價，結果顯示化合物2和3具有較好的抑制金黃色葡萄球菌活性，MIC值均為64 ?g/mL。化合物2和4均為首次從該植物中分離，化合物2和3可作為艾納香抗菌活性先導化合物，為相關新藥研發(fā)提供依據。

關鍵詞 艾納香；抗菌；化學成分；黃酮

中圖分類號 R284 文獻標識碼 A

Antibacterial Constituents of Ethyl Acetate Extract from Blumea balsamifera （L.） DC.

YUAN Yuan1， PANG Yuxin2， 3 *， YUAN Chao3

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 National Resource Center for Chinese Materia Medica， CACMS， Beijing 100700， China

3 Tropical crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Seven pure compounds were isolated by repeated column chromatography of silica gel， sephadex LH-20 and ODS reverse phase silica gel from the EtOAc extract of Blumea balsamifera （L.） DC.. The structures were elucidated to be 3，3'，5，7-tetrahydroxy-4'-methoxyflavanone （1）， 7-O-methyltaxifolin （padmatin） （2）， luteolin 7-methyl ether （3）， caffeic acid （4）， eriodictyol （5）， quercetin （6） and luteolin （7） on the basis of detailed spectroscopic analysis in conjunction with the published data. These compounds were evaluated for antibacterial activities against three bacteria including Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）， Escherichia coli （DSM 1116） and Bacillus subtilis （DSM 1088） by double dilution method. Bio-assay results showed that 2 and 3 exhibited inhibition against Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799） with MIC value of 64 ?g/mL， respectively. Compounds 2 and 4 were isolated from this plant for the first time， and compounds 2 and 3 could serve as a potential new drug.

Key words Blumea balsamifera （L.） DC.； antibacterial； chemical constituents； flavones

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.024

艾納香又名大風艾、冰片艾、大風葉等[1]，為菊科（Asteraceae）艾納香屬植物艾納香 [Blumea balsamifera （L.） DC.]的新鮮或干燥地上部分，其味辛、微苦、性溫、氣香，有祛風消腫[2]，活血止癢的功效，能夠治療風濕關節(jié)炎，濕疹，皮膚瘙癢等癥[3]。廣泛分布于海南、云南、貴州等省區(qū)，是黎族、苗族等少數民族的重要民族藥[4]。有關艾納香化學成分研究已經有數篇相關報道，主要有廣西師范大學的朱廷春[5]從艾納香乙酸乙酯部位中共分離得到11個化合物，其中9個為黃酮類化合物，僅對3種成分在艾納香中的含量進行了評價；上海交通大學的陳銘[6]從艾納香中分離得到32個化合物，包括黃酮類化合物13個、萜類13個和6個其他成分，只對部分萜類化合物進行了抑制 RAW264.7巨噬細胞產生NO活性評價；嚴啟新等[7]從艾納香中分離得到12個黃酮類化合物；譚道鵬等[8]從艾納香中分離鑒定出12個化合物，其中11個為黃酮類，包括3個黃酮苷類。但相關研究對艾納香中的黃酮成分生物活性報道較少。

本課題組前期研究顯示艾納香乙酸乙酯部位具有較好的抗細菌活性[9]，綜合考慮艾納香在海南黎族民間用于治療皮膚瘙癢以及熱水煮湯用于婦女產后沐浴，可殺菌止癢，有效地減少婦女疾病的發(fā)生[10]等用途，為進一步研究艾納香作為傳統(tǒng)民族草藥發(fā)揮抗菌作用的具體藥效物質基礎，本文對其乙酸乙酯部位進行進一步研究，并對其抗菌活性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌株 艾納香葉片于2017年5月采自海南省儋州市寶島新村，中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所艾納香資源圃，經中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]，標本保存于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥室。供試細菌菌株Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）、Escherichia coli （DSM 1116） 和 Bacillus subtilis （DSM 1088） 均由青島大學藥學院李剛老師提供。

1.1.2 儀器與試劑 核磁共振波譜儀（Bruker Avance-500MHz）；液質聯用儀：SYNAPT G2 HDMS 超高效液相飛行時間高分辨質譜聯用系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA， USA）；Waters 2489 半制備液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA， USA）；XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新風醫(yī)療器械有限公司）；R206B旋轉蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）； DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州廣源凈化科技有限公司）。

sephadex LH-20葡聚糖凝膠（GE Healthcare Bio-Sciences AB， Sweden）；ODS-A反相鍵和硅膠（北京慧德易科技有限責任公司）；柱層析硅膠（100-200目）、GF254薄層硅膠板、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 艾納香陰干葉片6 kg，揉碎，用95%甲醇回流提取，每次提取3 h，共提取2次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，用5倍體積的水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分減壓濃縮至干，得乙酸乙酯浸膏。

乙酸乙酯浸膏70 g，拌硅膠，上硅膠柱分離，依次用二氯甲烷/甲醇100/0、99/1、98/2、97/3、95/5、10/1、1/1、0/1梯度洗脫，根據薄層色譜檢測，合并，獲得9個組分，編號A、B、 C……I。組分D靜置，瓶子底部出現大量黃色結晶性粉末，濾出后得化合物1；組分E靜置，底部出現淡黃色粉末，濾出后，甲醇溶解，上sephadex LH-20柱層析，甲醇為洗脫劑，根據薄層色譜分析進行合并，得到化合物2和3；組分F用甲醇溶解，0.45微孔濾膜過濾，少量ODS-A拌樣，上ODS-A反相柱層析分離，依次用90%甲醇洗脫，100%甲醇洗脫，其中90% 洗脫部分濃縮至干，甲醇溶解，上sephadexLH-20柱層析，甲醇洗脫，洗脫餾分靜置，分別析出化合物4、5、6、7。

1.2.2 純度檢測和化合物結構確證方法 （1）純度檢測方法：獲得的7個化合物，分別采用薄層色譜結合高效液相色譜儀分析的方法確認純度，薄層色譜顯示為單一斑點，并且高效液相色譜圖上表現為單一色譜峰的，即可確認為純化合物，可進一步用于結構測試。

薄層色譜條件：GF254薄層硅膠板，展開劑：二氯甲烷/甲醇10/1，顯色劑：碘缸；

高效液相色譜條件：采用Waters 2489 半制備液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為YMC ODS-A（250×10 mm， 粒徑5 ?m），紫外檢測器，柱溫箱溫度為35 ℃，采用梯度洗脫系統(tǒng)：50%甲醇/水保持2 min，然后50%～100%甲醇/水用30 min，流速為2 mL/min。

（2）化合物結構確證方法：單體化合物的結構鑒定方法采用核磁共振技術（1H NMR、13C NMR）結合質譜技術，并通過相關物理常數的測定，與已知文獻數據的比對，對化合物進行結構確證。

1.2.3 化合物1～7的抑菌活性測定 -80 ℃保存的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp. Aureus），大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株室溫解凍后，接種到LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。將菌懸液在振蕩器上振蕩，血細胞計數板計數，調整菌懸液濃度為1×106 CFU/mL。將其用MHB培養(yǎng)液（牛肉粉2 g，可溶性淀粉1.5 g，酸水解酪蛋白17.5 g，溶于1 L蒸餾水中，pH 7.4，高壓蒸汽滅菌，即可）稀釋菌液1 000倍至103 CFU/mL，作為供試菌懸液。采用微量倍比稀釋法[11-12]測定化合物1～7對3株供試細菌的抑制活性，測定時每孔中最終菌懸液體積均為100 ?L，化合物1～7的濃度范圍為128～8 ?g/mL，培養(yǎng)板置37 ℃溫箱中培養(yǎng)過夜，觀察結果，鏈霉素為陽性對照，所有試驗重復3次，計算最低抑菌濃度（MIC）（表1）。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1，淺黃色粉末，mp 175-177 ℃，ESI-MS m/z 317 [M+H]+， 1H NMR （500MHz， DMSO-d6） δ：11.91 （1H， s， 5-OH）， 10.85 （1H， s， 7-OH）， 9.07 （1H， s， 3′-OH）， 6.95-6.89 （3H， m， H-2′， 5′， 6′）， 5.93 （1H， d， J=2.0 Hz， H-8 ）， 5.89 （1H， d， J=2.0 Hz， H-6）， 5.80 （1H， d， J=6.0 Hz， 3-OH）， 5.04 （1H， d， J=11.0 Hz， H-2）， 4.53 （1H， dd， J=11.0， 3.0 Hz， H-3）， 3.79 （3H， s， 4′-OCH3）. 13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 198.1 （C-4）， 167.3 （C-5）， 163.8 （C-9）， 162.9（C-7）， 148.4（C-4′）， 146.7 （C-3′）， 130.2 （C-1′）， 119.7 （C-2′）， 115.6 （C-6′）， 112.2 （C-5′）， 100.9 （C-10）， 96.5 （C-8）， 95.5（C-6）， 83.3 （C-2）， 72.0 （C-3）， 56.1 （4′-OCH3）。 以上數據，與Pang等[13]報道基本一致，確定該化合物為3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基-二氫黃酮（圖1）。

化合物2，淺黃色粉末，EIMS m/z 318 [M]+， 1H NMR（500MHz， DMSO-d6） δ： 11.87 （1H， s， 5-OH）， 9.06 （1H， s， 3′-OH）， 8.99 （1H， s， 4′-OH）， 6.90 （1H， s， H-2′）， 6.75 （1H， s， H-5′， H-6′）， 6.11 （1H， d， J=2.5 Hz， H-6）， 6.08 （1H， d， J=2.0 Hz， H-8）， 5.82 （1H， d， J=6.5 Hz， 3-OH）， 5.03 （1H， d， J=11.5 Hz， H-2）， 4.56 （1H， dd， J=11.0， 6.0 Hz， H-3）， 3.79 （3H， s， 7-OCH3）. 13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 198.9 （C-4）， 168.0 （C-7）， 163.5 （C-9）， 162.9 （C-5）， 146.3 （C-3′）， 145.4 （C-4′）， 128.3 （C-1′）， 119.9 （C-6′）， 115.8 （C-2′）， 115.6 （C-5′）， 101.8 （C-10）， 95.3 （C-6）， 94.2 （C-8）， 83.7 （C-2）， 72.1 （C-3）， 56.4 （7-OCH3）。以上數據與Ragaba等[14]基本一致，確定該化合物為7-甲氧基紫衫葉素（圖1）。

化合物3，白色粉末，mp 203-205 ℃，ESI-MS顯示分子離子峰 m/z 301 [M+H]+，1H NMR （500MHz， DMSO-d6） δ：12.99 （1H， s， 5-OH）， 7.46 （1H， d， J=2.5Hz， H-2′）， 7.44 （1H， dd， J=4.0， 2.0 Hz， H-6′）， 6.90 （1H， d， J=8.0Hz， H-5′）， 6.74 （1H， s， H-3）， 6.73 （1H， d， J=2.0 Hz， H-8）， 6.38 （1H， d， J=2.0 Hz， H-6）， 3.87 （3H， s， 3′-OCH3）. 13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 182.3 （C-4）， 165.6 （C-2）， 164.7 （C-7）， 161.7 （C-5）， 157.7 （C-9）， 150.4 （C-4′）， 146.3 （C-3′）， 121.8 （C-1′）， 119.6 （C-6′）， 116.4 （C-5′）， 114.0 （C-2′）， 105.1 （C-10）， 103.5 （C-3）， 98.4 （C-6）， 93.0 （C-8）， 56.5（-OCH3）。以上數據與黃永林等[15]報道基本一致，確定該化合物為木犀草素-7-甲醚（圖1）。

化合物4：白色粉末，mp 223-225 ℃，ESI-MS m/z 179 [M+H]+， 1H NMR （500MHz， DMSO-d6） δ： 7.43 （1H， d， J=15.5 Hz， H-7）， 7.05 （1H， d， J=1.5 Hz， H-2）， 6.97 （1H， dd， J=8.0， 1.5 Hz， H-6）， 6.78 （1H， d， J=7.5 Hz， H-5）， 6.20 （1H， d， J=16.0 Hz， H-8）. 13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 168.5 （C-9）， 148.6 （C-4）， 146.0 （C-7）， 144.9 （C-3）， 126.2 （C-1）， 121.6 （C-6）， 116.2 （C-8）， 115.8 （C-5）， 115.1 （C-2）。以上數據與Nakazawa等[16]報道基本一致，確定該化合物為咖啡酸（圖1）。

化合物5，無色針晶，mp 267-268 ℃，ESI-MS m/z 179 [M+H]+， 1H NMR（500MHz， DMSO-d6） δ： 12.15 （1H， s， 5-OH）， 6.89 （1H， s， H-2′）， 6.75 （2H， s， H-5′， 6′）， 5.88 （2H， d， J=1.5 Hz， H-6， 8）， 5.38 （1H， dd， J=12.5， 3.0 Hz， H-2）， 3.18 （1H， dd， J=17.0， 12.5， H-3b）， 2.68 （1H， dd， J=17.0， 3.0， H-3a）. 13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 196.8 （C-4）， 167.1 （C-7）， 163.9 （C-5）， 163.3 （C-9）， 146.2 （C-4′）， 145.6 （C-3′）， 129.9 （C-1′）， 118.4 （C-6′）， 115.8 （C-5′）， 114.8 （C-2′）， 102.2 （C-10）， 96.2 （C-6）， 95.4 （C-8）， 78.9 （C-2）， 42.5 （C-3）。以上數據與Haraguchi等[17]報道基本一致，確定該化合物為北美圣草素（圖1）。

化合物6，黃色粉末，mp：313-314 ℃，ESI-MS 顯示分子離子峰 m/z 303 [M+H]+。1H NMR （500MHz， DMSO-d6） δ：12.5 （1H， s， 5′-OH）， 7.69 （1H， d， J=2.5 Hz， H-2′）， 7.55 （1H， dd， J=7.5， 2.0 Hz， H-6′）， 6.90 （1H， d， J = 7.5 Hz， H-5′）， 6.42 （1H， d， J =1.5 Hz， H-8）， 6.20 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-6）。13C NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ ：176.3 （C-4）， 164.3 （C-7）， 161.2 （C-9）， 156.6 （C-5），148.1 （C-4′）， 147.2 （C-2）， 145.5 （C-3′）， 136.2 （C-3）， 122.4 （C-10）， 120.4 （C-6′）， 116.1 （C-5′）， 115.5 （C-2′）， 103.5 （C-1′）， 98.6 （C-6）， 93.8 （C-8）。以上數據與Saewanl等[18-19]和Nessa等[19]報道數據一致，因此鑒定該化合物為槲皮素（圖1）。

化合物7，白色粉末，mp：264-266 ℃，ESI-MS 顯示分子離子峰 m/z 287 [M+H]+。1H NMR （500MHz， DMSO-d6） δ：12.99 （1H， s， 5-OH）， 7.44 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-2′）， 7.41 （1H， dd， J =4.5， 2.0Hz， H-6′）， 6.91 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-5′）， 6.68 （1H， s， H-3）， 6.46 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-8）， 6.20 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-6）. 13C NMR （125MHz， DMSO-d6）： δ 182.1 （C-4）， 164.6 （C-7）， 164.3（C-2）， 161.9 （C-9）， 157.7 （C-5）， 150.1 （C-4′）， 146.2 （C-3′）， 122.0 （C-1′）， 119.4 （C-6′）， 116.5 （C-5′）， 113.8 （C-2′）， 104.1 （C-10）， 103.3 （C-3）， 99.3 （C-6）， 94.3 （C-8）。以上數據，與梁會等[20]報道基本一致，鑒定該化合物為木犀草素（圖1）。

2.2 對3株細菌的抑制活性

抑菌活性結果顯示，化合物2和3對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）具有較強抑制活性，MIC值均為64 μg/mL，同時，對大腸桿菌Escherichia coli （DSM 1116）也具有一定抑制活性，MIC值為128 μg/mL。

3 討論

艾納香為傳統(tǒng)黎族和苗族草藥，具有悠久的用藥歷史[21- 22]。艾渣為艾納香葉通過水蒸氣蒸餾提取了揮發(fā)性的小分子成分后剩余的殘渣。在貴州等艾納香主產區(qū)，老百姓采用蒸餾法提取艾粉和艾油后產生的大量艾渣，丟棄在河邊和田地，給生態(tài)環(huán)境帶來嚴重影響。然而艾渣中富含大量黃酮類成分，目前未被開發(fā)利用[23]。王秋萍等[24]用60%乙醇、90 ℃提取艾渣中黃酮含量，可達到2.9%。為艾渣中大量黃酮提取利用奠定基礎。黃酮類化合物作為天然產物中一大類重要成分，具有廣泛的生物活性，如郭志紅等[25]報道玉米須中的黃酮類成分具有調節(jié)血脂、 抗糖尿病、 抗心血管疾病、抗氧化活性、抗癌、抑菌、抗疲勞等廣泛的藥理活性；李聘等[26]報道益母草中黃酮類成分具有抗心肌缺血、促進心肌收縮、興奮子宮、抗氧化及抑菌等作用。暗示了黃酮類化合物潛在的抗菌活性價值。

從傳統(tǒng)中草藥或藥用植物中發(fā)現天然的抗菌物質，并應用于醫(yī)藥、食品、農業(yè)等各領域，也已成為一個大的發(fā)展趨勢。楊秀芳等[27]從一種樟科調味品植物木姜子的枝葉中獲得的一系列黃酮化合物，抗菌活性測試結果顯示其中大部分黃酮類成分均具有較好的抗菌活性，松屬素查兒酮對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC值均為12.5 ?g/mL，可用于食品的防腐儲存；芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷和異槲皮素對蘋果腐爛病菌、芍藥炭疽病菌等病原真菌具有較強抑制活性，具有開發(fā)成植物源農藥的前景。朱玥等[28]研究顯示苦參總黃酮對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、檸檬色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等均具有較好的抑制活性。很多黃酮化合物在在醫(yī)藥領域有很好應用，如高良姜中的黃酮類化合物高良姜素具有很好的逆轉耐藥菌株效果，Eumkeb等[29]報道高良姜素與頭孢他啶聯合用藥，可對耐β-內酰胺類抗生素的金黃色釀膿葡萄菌產生協同抗菌作用，進一步的抗菌機制研究表明，高良姜素對耐藥菌產生的青霉素酶和內酰胺酶有顯著的抑制作用。

綜上表明，植物源黃酮類成分是抗菌先導化合物發(fā)現的重要源泉。本研究從艾納香乙酸乙酯萃取部位中分離并鑒定了7個單體化合物，6個為黃酮類成分，其中化合物2和4均為首次從該植物中分離獲得。抑菌活性評價結果顯示，化合物2和3具有較好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌的MIC值均為64 μg/mL，對大腸桿菌的MIC值為128 μg/mL。本研究有助于艾納香這一傳統(tǒng)黎族和苗族草藥的現代化開發(fā)利用，為天然食品防腐劑和新藥研發(fā)等提供重要的備選先導化合物，同時也為艾納香產業(yè)中艾渣的再利用提供借鑒。

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