范士明 劉潤(rùn)嬌 趙園 李朔 李星馳 王鵬 劉守信

摘 要：Fmoc是一種常用的氨基保護(hù)基，傳統(tǒng)的脫除方法是通過加入二級(jí)胺與之作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。針對(duì)方法中存在的成本較高、使用的過量二級(jí)胺不易回收以及污染環(huán)境等缺點(diǎn)，建立了利用新型無(wú)機(jī)堿納米碳酸鉀非均相脫除Fmoc保護(hù)基的新方法。采用濕法研磨方法，將普通碳酸鉀制成粒徑為64 nm的納米碳酸鉀，以Fmoc保護(hù)的L-苯丙氨酸的脫保護(hù)反應(yīng)為Model反應(yīng)，確定了最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)溶劑為無(wú)水乙醇，F(xiàn)moc-L-Phe-OBn與納米碳酸鉀物質(zhì)的量比為1︰2，反應(yīng)溫度為25 ℃，高產(chǎn)率得到了相應(yīng)的游離氨基化合物，進(jìn)一步研究了新方法的適用范圍，對(duì)7個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸和二肽的底物進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，產(chǎn)率均在98%以上，且納米碳酸鉀能夠回收再利用，在5次之內(nèi)的活性幾乎沒有變化。新方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、污染小、碳酸鉀可回收利用的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多肽的合成及脫保護(hù)研究有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：有機(jī)合成化學(xué)； 納米碳酸鉀；Fmoc；脫保護(hù)；氨基酸； 肽

中圖分類號(hào)：O621 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1542（2018）03-0243-06

芴甲氧甲酰基（Fmoc）是一種重要的氨基保護(hù)基，對(duì)堿較為敏感，在有機(jī)合成反應(yīng)尤其是肽類化合物的合成中應(yīng)用廣泛[1-7]。 Fmoc能夠與對(duì)酸敏感的保護(hù)基Boc和Dmb，以及易氫解的保護(hù)基Cbz和Bn形成互補(bǔ)[8-11]。脫除Fmoc的經(jīng)典方法是使用二級(jí)胺，如哌啶、嗎啉、DBU或二乙胺等，在非水解的情況下將被保護(hù)的胺轉(zhuǎn)化為游離的氨基化合物[12-15]，但該方法面臨成本較高、使用的過量二級(jí)胺不易回收會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染等缺點(diǎn)[16-17]。近年來(lái)，納米化材料由于自身比表面積的提高，拓寬了應(yīng)用范圍，尤其是在化學(xué)、醫(yī)藥、材料等諸多領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)

用[18-20]。筆者先前報(bào)道了一種新型的無(wú)機(jī)堿——納米碳酸鉀，其平均粒徑為64 nm，相比普通的碳酸鉀，納米碳酸鉀在固態(tài)時(shí)顯示出更強(qiáng)的堿度，可以代替醇鈉（鉀）進(jìn)行活性亞甲基化合物的單烷基化和肟化反應(yīng)，且屬于非均相反應(yīng)，極易分離[21]。鑒于納米碳酸鉀的這種新特性，本文報(bào)道了一種利用納米碳酸鉀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的二級(jí)胺非均相脫除Fmoc保護(hù)基的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

NMR用Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振儀，瑞士Bruker公司提供；MS用Advion Mass Express液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，常州阿格拉新材料科技有限公司提供；ZF-2型三用紫外儀，上海市安亭電子儀器公司提供；85-1磁力攪拌器，河南鞏義市予華儀器有限公司提供；GZM-5高頻共振研磨機(jī)，北京開源多邦科技發(fā)展有限公司提供。所用試劑為分析純，均為市場(chǎng)直接購(gòu)買。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 納米碳酸鉀的制備

將150 g無(wú)水碳酸鉀、63 mL無(wú)水乙醇、0.435 g月桂酸倒入共振研磨機(jī)中，將混合物在室溫下研磨8 h，獲得粒徑為64 nm的K2CO3，密封，置于干燥器中備用[19]。

1.2.2 Fmoc保護(hù)的氨基酸及二肽的脫除通法

稱取1 mmol Fmoc保護(hù)的氨基酸芐酯、0.276 g（2 mmol）納米碳酸鉀，加入到100 mL的單口瓶中，加入50 mL無(wú)水乙醇，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h后過濾，用無(wú)水乙醇洗滌濾餅。將濾液冷卻至0 ℃，向其中加入2 mol/L HCl的Et2O溶液（2 mL，4 mmol），攪拌1 h。將濾液旋蒸濃縮，于殘留物中加入20 mL的Et2O使其固化結(jié)晶，經(jīng)減壓抽濾收集無(wú)色固體產(chǎn)物，真空干燥后得到相應(yīng)的氨基酸或二肽的鹽酸鹽。反應(yīng)路線如圖1所示。

1.2.3 目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

L-Leu-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Leu-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到白色固體L-Leu-OBn·HCl，收率為100%。1H-NMR（500 MHz，D2O，298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.18～7.16 （3H，t，J=10.0 Hz，—ArH）；5.34（2H，s，—CH2—）； 3.75～3.73（1H，m，—CH—）； 1.76～1.69（3H，m，—CH—，—CH2—）； 0.99～ 0.97（6H，t，J=10.0 Hz， —CH3）。EMI-MS（m/z）：223.1[M+H]+。

L-Phe-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Phe-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到白色固體，收率為99%。1H-NMR（500 MHz， D2O，298 K） δ： 7.65～7.64（4H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.58～7.56 （6H，t，J=10.0 Hz， —ArH）； 6.33（2H， s，—CH2—）； 4.58～4.55 （1H，dd，J=15.0 Hz，—CH—）； 3.63～3.43 （2H，m，—CH2）。EMI-MS（m/z）： 257.2[M+H]+。

L-Val-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Val-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到白色固體，收率為99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19 （2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.19～7.18 （3H， t， J=5.0 Hz，—ArH）；5.34 （2H， s，—CH2—）； 3.61～3.60 （1H，d，J=5.0 Hz，—CH—）； 2.29～2.25 （1H， m，—CH—）； 1.05～1.03 （3H， d，J=9.5 Hz，—CH3）； 0.99～0.98 （3H， d，J=10.0 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）： 209.1[M+H]+。

L-Pro-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Pro-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到白色固體，收率為98%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H， d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.33（2H， s，—CH2—）； 3.58～3.56（1H，t，J=10 Hz，—CH—）； 2.79～2.76（2H，m， J=15.0 Hz，—CH2）； 2.07～2.05（2H，m，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.63～1.62（2H， m，J=5.0 Hz，—CH2—）。EMI-MS（m/z）：207.6[M+H]+。

L-Gly-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Gly-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到白色固體，收率為99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H，t，J=5.5 Hz，—ArH）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 3.61（2H， s，—CH2）。EMI-MS（m/z）：167.1[M+H]+。

L-Leu-L-Phe-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Leu-L-Phe-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到黏稠黃色油狀液體，收率為98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.28～7.26 （4H， d， J=10.0 Hz，—ArH）； 7.11～7.10 （6H，t，J=5.0 Hz，—ArH）； 4.78～4.76 （1H，q，J=10.0 Hz，—CH—）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 4.11（1H， s， —CH2）； 3.12～3.10（2H， d，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.66～1.64（3H， m，—CH2—，—CH—）； 0.89（3H， s，—CH3）。EMI-MS（m/z）：370.2[M+H]+。

L-Pro-L-Leu-OBn·HCl：依據(jù)通法，脫除Fmoc-L-Pro-L-Leu-OBn中的保護(hù)基Fmoc，處理后得到黏稠黃色油狀液體，收率為98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.21～7.20 （2H， d， J=5.0 Hz，—ArH）； 7.19～7.18（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.34 （2H， s，—CH2—）； 4.68（1H， s，—CH—）； 4.54～4.52（1H， t，J=10.0 Hz，—CH—）； 3.50（2H， s，—CH2—）； 2.14～2.11（4H， m，—CH2—）； 1.68～1.60（3H， m，—CH2—， —CH—）； 0.92～0.89（3H， q，J=14.5 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）：319.2[M+H]+。

1.2.4 納米碳酸鉀的回收利用

反應(yīng)結(jié)束后，過濾并用無(wú)水乙醇（3×30 mL）洗滌得到的濾餅，常溫風(fēng)干后，經(jīng)馬弗爐中于250 ℃ 煅燒4 h，經(jīng)回收后得到無(wú)水碳酸鉀，再次研磨得到納米碳酸鉀，實(shí)現(xiàn)利用。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)前文的實(shí)驗(yàn)及分析過程，為了得到理想的結(jié)果，需對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以下是以Fmoc-L-phe-OBn為例的反應(yīng)方程式。

由于脫除Fmoc后產(chǎn)生的氨基容易與羧酸甲酯發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇較為穩(wěn)定的Fmoc-L-Phe-OBn為底物進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。為了獲得理想的反應(yīng)結(jié)果，考察了反應(yīng)溶劑、納米碳酸鉀的用量以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)收率的影響，結(jié)果見表1。

由表1可以看出：1）以市售普通碳酸鈉和普通碳酸鉀為堿時(shí)，反應(yīng)不發(fā)生，而以納米碳酸鉀為堿時(shí)，則能順利進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)。相比于普通碳酸鉀，納米碳酸鉀擁有更大的比表面積，能夠?qū)⒏嗟腃O2-3暴露在固體表面，因而展現(xiàn)出更強(qiáng)的堿強(qiáng)度[21]。2）相比于乙腈和DMF，質(zhì)子極性溶劑乙醇和甲醇能夠與納米碳酸鉀的表面電荷形成較強(qiáng)的氫鍵作用，在反應(yīng)中阻礙納米碳酸鉀的團(tuán)聚而導(dǎo)致堿性降低。因此，當(dāng)以乙醇或甲醇為溶劑時(shí)，產(chǎn)率最高。經(jīng)比較，最終選擇了毒性相對(duì)小的乙醇。3）當(dāng)納米碳酸鉀的用量提高到Fmoc-L-Phe-OBn的2倍時(shí)，產(chǎn)率從88%升高到96%，繼續(xù)增加納米碳酸鉀用量，產(chǎn)率基本不再變化。這可能是因?yàn)榧{米碳酸鉀作為堿奪取Fmoc基團(tuán)次甲基上的質(zhì)子后，變成碳酸氫鉀，堿性變?nèi)醵ピ俅畏磻?yīng)的活性；同時(shí)，盡管使用的是納米碳酸鉀，但反應(yīng)仍屬于表面反應(yīng)，與溶液反應(yīng)相比，表面堿位點(diǎn)不可能完全暴露出來(lái)，所以適當(dāng)增加堿的用量有助于提高收率。4）當(dāng)納米碳酸鉀的用量為2 mmol時(shí)，反應(yīng)收率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，6 h時(shí)產(chǎn)率最高，幾乎能定量脫除。最終，確定最優(yōu)反應(yīng)的條件如下：納米碳酸鉀用量為2 mmol ，無(wú)水乙醇為溶劑，反應(yīng)時(shí)間為6 h（實(shí)驗(yàn)編號(hào)9）。

2.2 反應(yīng)底物的拓展

為了驗(yàn)證此方法的可行性，需對(duì)反應(yīng)底物進(jìn)行拓展實(shí)驗(yàn)，以下是反應(yīng)通式。

基于上述納米碳酸鉀為堿脫除Fmoc-L-Phe-OBn中Fmoc保護(hù)基的優(yōu)化反應(yīng)條件，為了考察其方法的通用性，進(jìn)一步拓展了7種不同的底物，包括Fmoc保護(hù)的氨基酸和二肽，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，無(wú)論是氨基酸還是二肽，所有底物用納米碳酸鉀均可有效脫除Fmoc保護(hù)基，所得產(chǎn)物的收率均在98%以上，表明此種方法具有很好的通用性。

2.3 納米碳酸鉀的回收

Fmoc-L-Leu-OBn的脫保護(hù)反應(yīng)完成后，回收納米碳酸鉀，重復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)5次，考察其活性對(duì)反應(yīng)收率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，納米碳酸鉀在重復(fù)使用5次后，產(chǎn)率幾乎無(wú)變化。相比于傳統(tǒng)的胺類化合物，Nano-K2CO3具有回收簡(jiǎn)單、可重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)，降低了反應(yīng)成本，減少了對(duì)環(huán)境的污染程度。

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立了一種利用納米碳酸鉀脫除Fmoc的新方法。采用納米級(jí)碳酸鉀替代傳統(tǒng)的有機(jī)胺類，對(duì)Fmoc保護(hù)的氨基酸芐酯和二肽芐酯進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，產(chǎn)率均高于98%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、污染小以及可重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多肽的合成及脫保護(hù)研究有重要的參考價(jià)值。但本研究缺少對(duì)其他類型無(wú)機(jī)堿的考察，有待今后作進(jìn)一步的探索。

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