孟贊 唐櫟

摘 要：改進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。取新生24 h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)組織，采用機(jī)械性吸管吹打的方法獲取細(xì)胞懸液，進(jìn)行種植培養(yǎng)，Galc免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定少突膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)Galc免疫細(xì)胞化學(xué)染色，少突膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%。采用此種方法培養(yǎng)出的少突膠質(zhì)細(xì)胞純化度高，且方便簡(jiǎn)易。

關(guān)鍵詞：少突膠質(zhì)細(xì)胞；分離培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)器械

鐘表鑷2把；眼科剪3把；小彎鑷3把；大剪及大鑷各1把；玻璃平皿3個(gè)；75cm2培養(yǎng)瓶；試管數(shù)只；試劑瓶數(shù)個(gè)彎；頭吸管1個(gè)；計(jì)數(shù)板1個(gè)；冰板1個(gè)；白磁盤1個(gè)；飯盒蓋1個(gè)；解剖鏡一臺(tái)。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/HIGHGLUCOSE；Nueroobasal；D-hanks液（無酚紅）；0.25%胰蛋白酶；青霉素和鏈霉素雙抗；多聚賴氨酸；胎牛血清；馬血清；DNA酶；谷氨酰胺；bFGF；PDGF- AA；Galactocerebroside，GalC抗體；小鼠抗大鼠 A2B5 單克隆抗體 IgM。

三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

取材前一天，將所有金屬器械置于同一個(gè)鋁盒中高壓消毒，玻璃器皿置于另外一個(gè)飯盒中高壓消毒，2小時(shí)后取出放到烘干箱中烘干備用。包被：將0.1mg/ml多聚賴氨酸溶液吸到六孔板/皿中，平置30分鐘后，吸棄賴氨酸溶液，晾干。用前用高壓過的去離子水洗三遍，再晾干備用。領(lǐng)取新生48h之內(nèi)的SD大鼠。實(shí)驗(yàn)前一天將高糖DMEM在孵育箱中孵育過夜。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取出高壓滅毒物品，置于超凈臺(tái)中。

（2）在冰板上放置玻璃培養(yǎng)皿，皿中均加入適量解剖液，預(yù)留最后一套小培養(yǎng)皿不加。

（3）用75%酒精泡上鐘表鑷。

（4）配制3ml0.125%胰蛋白酶：1.5mL 0.25% 胰蛋白酶；300μL 0.1% DNA酶；解剖液稀釋至3 mL。

（5）取新生24h內(nèi)SD大鼠，75%的酒精消毒頭部皮膚，用眼科剪依次切開皮膚顱骨及硬腦膜，然后取出腦組織放在PBS緩沖液中，將取出的腦組織放在解剖顯微鏡下，用小鑷子剝除軟腦膜、腦干、海馬及血管組織。剩余的腦皮質(zhì)切成1mm2的組織小塊，放入盛有PBS的離心管中，然后用吸管輕輕反復(fù)的吹打。

（6）用 70μm 篩網(wǎng)過濾，剪碎后在 0.125%的胰蛋 白酶 中 37℃消化15min，用含有血清的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化。輕輕吹打使細(xì)胞分散后，離心機(jī)l000 r/min離心lOmin，棄去上清液，加入10%FCS+DMEM/F12的培養(yǎng)液重懸離心后的細(xì)胞，細(xì)胞以約106/cm2濃度種植在75cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

（7）細(xì)胞放入5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約40min，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶幾次后吸出細(xì)胞懸液，取出已經(jīng)貼壁了的貼壁細(xì)胞，主要是成纖維細(xì)胞，把細(xì)胞的懸液種植在涂有多聚賴氨酸75cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 8至10ml的10%FCS+DMEM/F12的培養(yǎng)液。

（8）有細(xì)胞種植的培養(yǎng)瓶靜置3天，3天后隔天換液，培養(yǎng)至第9天。

（9）少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：在接種9天，細(xì)胞達(dá)到融合后，根據(jù)少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞系黏附特性的差異和生長時(shí)間的不同，本實(shí)驗(yàn)采取差速震蕩法對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離和純化。首先在37℃恒溫?fù)u床上低速震蕩來去除小膠質(zhì)細(xì)胞（200rpm，1h—2h），此處收集小膠質(zhì)細(xì)胞（收集振搖下來的細(xì)胞懸液，1000xg在4℃離心10 min，棄上清，細(xì)胞用適量完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿中，4 h后收集未貼壁細(xì)胞。換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。原混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，PBS洗滌2次，加入新鮮培養(yǎng)液，不換液培養(yǎng)7 d，按上述方法再次獲得MG）更換（10%FCS+DMEM/F12）培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～4h 后再放入37℃培養(yǎng)箱。在恒溫?fù)u床上用高速震蕩法過夜（200rpm.，18～20h），此時(shí)收集的搖下來的細(xì)胞用吸管收集種植在未處理過的培養(yǎng)瓶上，把培養(yǎng)瓶放在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)30至60min，目的是使混雜在細(xì)胞懸液中的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁，然后把細(xì)胞懸液種植在涂有多聚賴氨酸75cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)液為含含有細(xì)胞因子的少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液，采取半量換液法隔天換液，培養(yǎng) 4-5 天，促進(jìn) OPCs 分裂增殖，再次在恒溫?fù)u床上用高速震蕩法 （180rpm，1h）分離傳代，進(jìn)一步使少突膠質(zhì)細(xì)胞純化。

（10）用細(xì)胞免疫熒光法鑒定少突膠質(zhì)細(xì)胞并測(cè)算少突膠質(zhì)細(xì)胞純度。24孔板每孔底部放置孔徑相同的的載玻片，少突膠質(zhì)細(xì)胞以3×104/L的密度種植在24孔板上培養(yǎng)1天。1天后吸棄24孔板上的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌少突膠質(zhì)細(xì)胞3次，每次10min。用4%的多聚甲醛固定玻片約20min，PBS緩沖液浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS。在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋小鼠抗大鼠 A2B5 單克隆抗體，稀釋度為1：500，放入濕盒，4℃孵育過夜。第二天，PBS緩沖液浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的山羊抗小鼠 IgM 抗體，濕盒中37℃孵育1h，PBS緩沖液浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS緩沖液5min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。隨機(jī)選取20個(gè)視野在熒光顯微鏡下觀察，免疫熒光染色陽性細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞體細(xì)胞，計(jì)數(shù)攝影；同一視野于普通光條件下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞細(xì)胞純度。