李曉菲 陳婷 孫愛(ài)榮 黃艷 葛曉杰 徐婷 王彩宏 秦立廷

摘要：為了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2）并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，試驗(yàn)根據(jù)PCV2基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一種特異性檢測(cè)PCV2的TaqMan熒光定量方法。結(jié)果表明：該方法特異性良好;在5.Oxl0¹～5.O×l0⁹拷貝/u L模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;敏感性是常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PoLymerase Chain Reaction，PCR）方法的100倍：重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于1.5%。與常規(guī)PCR方法相比，該方法對(duì)臨床樣品的檢出率更高。該方法的建立為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及研究PCV2核酸載量與臨床致病性關(guān)系提供了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;熒光定量方法;臨床樣品

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0769（2018）10-0030-03

豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovlrus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是一種無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，也是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。PCV具有三個(gè)血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是一種可以感染豬的常規(guī)病毒，對(duì)豬無(wú)致病性。PCV2于1998年首次報(bào)道，對(duì)豬具有致病性，臨床上主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及呼吸道和腸道疾病。2016年10月美國(guó)報(bào)道出現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒血清型-PCV3，該病毒能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。

目前，PCV2臨床樣品常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、間接免疫熒光試驗(yàn)、病毒分離鑒定以及序列測(cè)定等。這些常規(guī)方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，并且在PCV2檢測(cè)時(shí)特異性和敏感性存在不足。熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上引入了熒光探針，使得檢測(cè)方法具有更高的特異性和敏感性，并且PCR結(jié)束后可以直接觀察結(jié)果，無(wú)須進(jìn)一步凝膠電泳。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，最快可以在2h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果。

本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)PCV2及其病毒載量的TaqMan熒光定量PCR方法，為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒定量及流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的工具。

1 材料與方法

CFX96熒光定量PCR儀和Tl00梯度PCR購(gòu)自伯樂(lè)公司、分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自AxyGen公司、核酸提取試劑盒購(gòu)自invitrogen公司、PCR酶購(gòu)自全式金公司、Premix Ex Taq （Probe qPCR）購(gòu)自寶生物公司。

1.2引物探針設(shè)計(jì)與合成

應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)多個(gè)PCV2基因序列進(jìn)行比較分析，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針。上游引物序列為：5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3，下游引物序列為：5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3。探針序列為：5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3，其中，探針5端標(biāo)記FAM，3端標(biāo)記MGB。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品制備

通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增PCV2目的基因，然后將目的產(chǎn)物回收、純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

首先通過(guò)溫度梯度PCR確定引物的最適退火溫度，然后用矩陣法對(duì)探針和引物的用量進(jìn)行摸索與改進(jìn)，獲得最適合的探針引物濃度配比，確定反應(yīng)體系。將1.3中制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋?zhuān)♂尯髮?duì)5.0×10¹～5.0×10⁹拷貝/u L濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的熒光定量方法對(duì)豬瘟病毒（ClassicalSwine Fever Virus，CSFV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudoraloies Virus，PRV）、PCV3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible GastroenteritisVirus，TGEV）、豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）和豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）等病毒的互補(bǔ)DNA（Complementary DNA，cDNA）或DNA進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證該方法的特異性。將陽(yáng)性DNA按10倍稀釋至最低濃度為6. 12×10¹拷貝/u L，進(jìn)行PCR反應(yīng)，比較兩種檢測(cè)方法的敏感性。用5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行4次批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，并且根據(jù)C₊值計(jì)算變異系數(shù)。

1.6臨床樣品檢測(cè)

由本實(shí)驗(yàn)室收集可疑PCV2臨床樣品78份，分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和常規(guī)PCR檢測(cè)，比較分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增PCV2目的基因（圖1），產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒即為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)定DNA濃度后，換算成拷貝數(shù)為5.0×10⁹拷貝/u L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2反應(yīng)條件優(yōu)化

熒光定量PCR反應(yīng)體系共為25 uL，含12.5 uL2×Premix Ex Taq、10uL RNase-free water、0.5 uL探針（10 uM）、0.5U L上游引物（10 uM）、0.5 uL下游引物（10 uM）、1 uL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)條件為：95℃3 min; 94℃15 s，60℃35 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取濃度為5.0×10¹～5.0×10⁹拷貝/uL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增后獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2和圖3可知，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功，可用于臨床樣品的檢測(cè)。

2.4特異性試驗(yàn)

用所建立的熒光定量PCR方法對(duì)CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV、RV、PPV和PCV3等病毒的cDNA或DNA的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法與這些病毒無(wú)交叉反應(yīng)（圖4），試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

2.5敏感性試驗(yàn)

熒光定量PCR方法能檢出的最低模板濃度為5.0×10¹拷貝/uL（圖2），而常規(guī)PCR能檢出的最低模板濃度為6. 12×10³拷貝/uL（圖5），試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR方法的敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍左右。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

用5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.5%（表1），表明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.7臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的可疑PCV2臨床樣品78份，分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和常規(guī)PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，熒光定量PCR方法陽(yáng)性檢出率（60.3%）比常規(guī)PCR方法（48.7%）更高（表2）。說(shuō)明所建立的熒光定量方法比常規(guī)方法具有更高的敏感性，更適用于PCV2的臨床檢測(cè)，尤其是感染早期病毒含量較低時(shí)。

3 討論

PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征和其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的原發(fā)性病原。雖然PCV2所導(dǎo)致的豬群發(fā)病率和死亡率不高，但PCV2主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，干擾和破壞豬對(duì)其他疫病免疫抗體的產(chǎn)生和維持，從而繼發(fā)其他疾病，多種疾病引起的混合感染使死亡率升高，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，PCV2的危害性不能孤立而言，更主要是表現(xiàn)在與其他疾病的繼發(fā)混合感染。

目前，PCV2的檢測(cè)以血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)為主。由于受到母源抗體的影響，血清學(xué)抗體檢測(cè)普遍呈陽(yáng)性，臨床指導(dǎo)意義不大。因此病原學(xué)檢測(cè)對(duì)于PCV2的預(yù)防與控制尤為重要。由于PCV2臨床發(fā)病與亞臨床感染豬群中病毒含量存在明顯不同，PCR靈敏度較差，易造成漏檢，而熒光定量PCR方法可以對(duì)抗原含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，敏感性高，特異性好，并且整個(gè)過(guò)程所需時(shí)間更短，因此在病原檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

本研究根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）中PCV2基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一種快速檢測(cè)PCV2病毒載量的TaqMan熒光定量PCR方法。通過(guò)優(yōu)化，使該方法在5.0×10¹～5.0×10⁹拷貝/uL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍。綜上所述，該方法的建立為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及研究PCV2核酸載量與PCV2臨床致病性關(guān)系提供了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)依據(jù)。

（參考文獻(xiàn)：3篇，略）