侯 吉，李小林，田衛(wèi)東

(1.復旦大學 生命科學學院 生物統(tǒng)計學與計算生物學系，上海 200438; 2.上海出入境檢驗檢疫局 上海 200135)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)又稱老年癡呆癥，是一種進行性神經障礙疾病，嚴重危害老年人身心健康[1]．記憶喪失，思維能力，推理能力下降以及個性和行為的變化是AD的主要特征[2]．其病理特征是在AD患者的大腦中形成細胞外淀粉樣斑塊和細胞內神經原纖維纏結．主要原因是淀粉樣蛋白β肽(Aβ)的過量產生，導致淀粉樣蛋白斑積聚．這種過量產生是由于親本淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的內切蛋白，其被α-酶復合物，β-酶復合物和γ-酶復合物的分泌酶切割[3]．大腦中Aβ的產生增加和清除率降低會導致疾病發(fā)展過程中的突發(fā)事件級聯，包括突觸損傷，高磷酸化tau(p-tau)，線粒體結構和功能變化，炎癥反應，激素失衡，細胞周期變化和神經元損失[4-6]．在全球范圍內，大約有超過4000萬個60歲以上的老人患有阿爾茨海默癥，患者人數增長趨勢不斷上升，甚至每20年翻一番[7-8]．

近年來，AD的預防及治療的相關研究雖然已經取得了很大的進步，一些新的藥物也被陸續(xù)研發(fā)出來，但真正具有明顯臨床效果的卻是鳳毛麟角．因此，有必要對歷年來所有可用于治療AD的藥物進行匯總整理，運用生物信息學和系統(tǒng)生物學整合各層面的數據進行有效深入分析，預測未知的AD靶基因．對于進一步指導AD藥物開發(fā)以及對已有藥物臨床綜合使用具有重要的意義．

1 數據和方法

1.1 數據的收集和處理

DrugBank數據庫是本文研究的核心．DrugBank(http：∥www.drugbank.ca)是一個綜合的在線數據庫，其中包含許多藥物及其相關作用機制以及廣泛的生物化學和藥理學信息．該數據庫將詳細的藥物(即化學、藥理和藥物)數據與綜合藥物靶標(即序列、結構和途徑)信息相結合．數據庫中總共包含了9591個藥品，包括美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的2037個小分子藥物，241個FDA批準的生物技術(蛋白質、肽)藥物，96個營養(yǎng)藥物和6000多個實驗藥物．此外，4661非冗余蛋白(即藥物靶標、酶、轉運蛋白、載體)的序列與這些藥物的關系也被儲存在這些條目中．每個藥物數據條目包含超過200個數據字段，其中一半的信息是藥物、化學數據，另一半是藥物靶標或蛋白質數據．

本次研究從DrugBank數據庫中下載drugbank_all_full_database.xml.zip文件，解壓后得到full database.xml即DrugBank全藥物數據信息．通過DrugBank(http：∥www.drugbank.ca)的高級搜索功能找出所有可用于治療AD的藥物及其ID．而后通過數據匹配，從DrugBank全藥物數據信息中挖掘得到221個AD的靶基因．

1.2 功能富集分析

通過DAVID(https：∥david.ncifcrf.gov/)網站使用基因本體(Gene Ontology, GO)進行功能富集分析，以P<0.05(FDR校正)為標準篩選得到靶基因所參與的一系列生物學過程(Biological Process, BP)．進一步通過Gene Ontology數據庫挖掘出這些生物過程中所有的相關基因，稱之為ADTarget_BP(AD Target from Biological Process)．同時，根據富集得到的生物學過程進一步分析其與AD的聯系．

1.3 靶基因預測

μa是a基因的網絡原始平均距離：

其中N為所有網絡基因的總數(19038)．

最終可計算得到網絡中各個基因關于某個疾病的權重：

K為所有疾病基因的總數[11]，在本研究中即為AD靶基因的個數(221)．

本研究將使用矯正后的距離Dadj來計算靶基因子網絡的平均距離和10000個隨機相同數量基因(221個)子網絡的平均距離，并進行比較．由此得出靶基因子網絡的平均距離是否較小，即靶基因在整個基因網絡中是否相對聚集．

對于聚集度較高的靶基因子網絡，進一步使用GenePANDA預測AD的靶基因，由此獲得到更好的預測結果[11]．將AD的221個已知靶基因輸入GenePANDA預測工具，進而得到網絡中所有19038個基因關于AD靶基因預測的分數排名，分數排名越高則代表預測基因和原始AD靶基因集的關系越密切．本次研究提取分數排名前100的基因，而后將該基因集中包含的已知AD靶基因去除，得到GenePANDA初步預測的AD靶基因集．再將該基因集進行整理，去除其中已知的靶基因，最后得到GenePANDA實際預測的AD靶基因集，稱之為ADTarget_GP(AD Target from GenePANDA)．將ADTarget_GP與ADTarget_BP取交集，得到最終預測的AD靶基因集，稱之為ADTarget_PT(AD Target from Predict)．

1.4 治療AD藥物預測

將預測得到的AD靶基因集合ADTarget_PT與DrugBank全藥物數據庫(full database.xml)進行匹配，得到這些靶基因的相關藥物，該些藥物即為預測得到可用于治療AD的潛在藥物．

2 結果和分析

2.1 靶基因本體(Gene Ontology, GO)富集分析

在DAVID網站對221個AD的已知靶基因使用Gene Ontology做功能富集分析，以P<0.05(FDR校正)為標準篩選得到顯著富集的78個生物學過程．

圖1 已知AD靶基因功能富集生物過程Fig.1 Functional enrichment biological process of known AD target genes從上到下包括GO：0007271，0035094，0042493，0007165，0098655，0007268，0007274，0001975，0007187，0071880，0035235，0007200，0045471，0042220，0035095，0007626，0006939，0019229，0031000，0008542，0045907，0060134，0014059，0007197，0070374，0007194，0007207，0032496，0006940，0007190，0008284，0042310，0045944，0043406，0007613，0007193，0009636，0008217，0007204，0007267，0007568，0006874，0001963，0042391，0006811，0043410，0045429，0000187，0006954，0001666，0007166，0050795，0001973，0001659，0008285，0019233，0030335，0042053，0042346，0045987，0007188，0042417，0001994，0007612，0000165，0048661，0006810，0051209，0071222，0007210，0030168，0042420，0031622，0038170，0048148，0070588，0050796，0032729.

由圖1可知，已知的AD靶基因主要與膽堿能傳遞、尼古丁反應、藥物反應、信號轉導、陽離子轉運、化學傳播、神經肌肉突觸傳播等生物學過程相關．這些生物學過程已有多項被報道與AD有關．例如，實驗證實尼古丁可在體外分解預先形成的β-淀粉樣蛋白原纖維[12]．而膽堿能傳遞更是與AD治療息息相關，有研究發(fā)現新分子能夠通過靶向膽堿能系統(tǒng)，直接對膽堿受體進行刺激并加入到乙酰膽堿酯酶抑制劑中，抑制β-淀粉樣蛋白聚集[13]．此外，與谷氨酸能功能障礙相關的化學生物學過程也與治療AD有密切關系[14]．而涉及神經肌肉突觸傳播的生物學過程的突觸功能障礙和認知衰退也被證明是阿爾茨海默病的早期特征[15]．盡管如此，富集的78個生物學過程仍有一些并未發(fā)現有與AD相關的直接研究證據，如陽性調節(jié)平滑肌細胞增殖、鈣離子跨膜運輸等．基于我們的分析結果，這些尚未有證據證明與AD相關的生物學功能特征，或許將是未來阿爾茨海默癥研究領域的新方向．

基于上述對78個生物學過程與AD相關性的分析，我們有理由相信參與這些生物過程的基因也與AD相關．而后通過編寫程序獲取78個生物學過程在GO數據庫中相關的所有基因，即ADTarget_BP，共3350個．

2.2 AD靶基因預測結果

對AD的221個已知靶基因作網絡距離校正，得到Dadj，并計算得到AD靶基因子網絡的平均距離為0.7089，通過編寫程序從19038個基因中隨機抽取子網絡10000次，每次抽取與已知靶基因相同數量的221個基因，得出的子網絡平均距離分布見圖2(看54頁)．

由圖2可知，AD靶基因子網絡平均距離顯著小于隨機子網絡平均距離(P<10-4)，即AD靶基因在整個基因網絡中顯著聚集．因此使用GenePANDA對AD的靶基因進行預測，結果將更可靠．

將收集到的221個AD靶基因輸入至GenePANDA預測工具后，我們得到整個基因網絡中所有關于AD靶基因的預測結果，即19038個基因的分值排名．本次研究截取分值排名前100的預測靶基因作為研究對象．將其中已知AD靶基因去除后，得到預測的AD靶基因集合，ADTarget_GP，共有86個基因．而后，將ADTarget_GP與上述ADTarget_BP取交集，最終得到預測的AD靶基因集，即ADTarget_PT，共有66個基因．對66個預測AD的靶基因進行文獻查閱驗證，驗證結果如表1所示．

圖2 已知AD靶基因子網絡示意圖及其平均距離Fig.2 Gene sub-network diagram and its average distance of known AD target genes

表1 阿爾茨海默癥預測靶基因驗證結果表

通過查詢文獻，上述報道有用于治療AD的靶基因或與AD直接相關的基因共有30個基因．例如，氧雜雙環(huán)庚烯磺酸鹽通過激活GPER1，提供了針對增強膠質細胞存活的保護，從而治療AD[16]．還有實驗證明導致AD中海馬POMC電路缺陷的潛在細胞機制很重要，識別補充POMC衍生肽的儲存和維持MC4R活化的方法對于緩解海馬突觸可塑性損傷至關重要，因此POMC/MC4R電路是AD相關認知功能障礙的潛在治療靶點[17]．M13家族的酶已被確定為腦內Aβ分解代謝的主要介質．因此，這些酶對AD具有顯著的病理和治療意義．而大腦中SSTR4作用的選擇性增強有可能通過調節(jié)這些酶來減輕毒性Aβ42寡聚體的積累[18]．另外，有研究證明GALR2參與對空間記憶障礙和海馬Aβ聚集的保護作用[19]．

2.3 治療AD藥物預測結果

上述文獻驗證的研究結果表明預測得到的AD靶基因(ADTarget_PT)與AD密切相關，靶向這些基因的藥物則可潛在治療AD．因此，本研究進一步從DrugBank藥物數據庫(full database.xml)中挖掘靶向66個預測的靶基因的藥物，進一步獲得我們預測靶基因的研究價值．在66個預測的靶基因中，18個基因有對應的靶向藥物．最終共得到44種可潛在用于治療AD的藥物，其中有10種藥物已被研究可用于治療AD，詳見表2．

表2 DrugBank中靶向預測基因的藥物

*： 已被研究可用于治療阿爾茨海默癥的藥物．

圖3 預測用于治療AD藥物分類圖Fig.3 Classification of predicted drugs for the treatment of AD

在這44種藥物中有21種藥物是可被用于治療抑郁癥、偏頭痛等疾病的神經類治療藥物，另外23種藥物是可被用于治療艾滋病、哮喘等疾病的非神經類治療藥物(圖3，看56頁)．在神經類治療藥物中有阿米替林、奧氮平、氯氮平、阿莫沙平、α-氨基異丁酸和組胺共6種藥物對AD有治療作用．例如，阿米替林是預測得到的用于治療各型抑郁癥或抑郁狀態(tài)的神經類治療藥物．有研究顯示，阿米替林在老年患者損傷的AD腦中具有顯著的治療作用，并且它顯示出作為治療AD的可耐受的新型治療劑的希望[20]．此外，阿莫沙平也是預測得到的神經類治療藥物，它是一種二苯并氧氮卓三環(huán)類抗抑郁藥．研究表明，阿莫沙平通過多種HTR6介導的靶標(包括β-arrestin2和CDK5)降低了Aβ的產生．阿莫沙平雖然不再是治療抑郁癥的一線藥物，但可能有益于治療AD，而進一步用三氯乙酸(TCA)對其結構進行修飾發(fā)現，它可作為治療AD的理想治療劑[21]．在非神經類治療藥物中有地塞米松、吲哚美辛、舒林酸和酮洛芬共4種藥物對AD有治療作用．例如，地塞米松是一種抗炎糖皮質激素，可用于治療哮喘、風濕性疾病等．有實驗發(fā)現地塞米松在特異性位點顯著降低了由糖原合酶激酶-3β蛋白水平活性降低介導的tau磷酸化，在改善AD認知障礙中起重要作用[22]．

3 討 論

本次AD靶基因和藥物的預測研究，通過整理其已知靶基因，使用功能富集分析、網絡分析預測、數據匹配和大量文獻查閱等方式得到的實驗結果將為AD藥物的開發(fā)和臨床治療提供重要的參考意義．預測得到的66個基因中，一些基因是被上述文獻證實是有效作用于AD的靶基因或與AD直接相關的靶基因，一些基因則是與腦神經相關的靶基因，而另一些雖沒有被報道，也為后續(xù)的科學研究提供可行性依據．

此外，AD藥物開發(fā)成本高，近幾年許多大公司諸如輝瑞(Pfizer)、強生(JNJ)、禮來(Eli Lilly)和羅氏(Roche)等均為此折戟，同時這些公司也因巨額的藥物開發(fā)成本而受到非常沉重的打擊．截至目前，始終沒有一款對AD完全有效，并且適用于所有患者的治療藥物．本次研究預測得到6種神經類治療藥物和4種非神經類治療藥物均已被研究可用于治療AD．Hirohata等研究得到非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs，NSAID)可以抑制來自Aβ的fAβ形成和體外預先形成的fAβ，對AD β-淀粉樣蛋白原纖維具有抗淀粉樣變性作用，可有望預防和治療AD[23]．而本研究預測得到可用與治療AD的4種非神經類治療藥物除上述地塞米松外，余下3種藥物吲哚美辛、舒林酸和酮洛芬均屬于非甾體抗炎藥．而6種神經類治療藥物中，α-氨基異丁酸被Gozes等研究證明可以保護神經元抵抗AD相關的Aβ1-42毒性，抑制tau衍生肽的聚集[24]．而余下的5種預測藥物阿米替林、奧氮平、氯氮平、阿莫沙平和組胺均是靶向與AD有直接關系的HRH4基因(表2)．低劑量奧氮平似乎對于治療老年患者的AD引起的行為障礙和精神病癥狀而言是有效的，并有良好的耐受性[25]．而Choi等認為氯氮平可作為AD治療多靶標方法的候選者[26]．此外，有研究顯示組胺有利于AD病理的治療[27]．

預測藥物靶基因的一個應用方面是幫助新藥物的開發(fā)[28]，而藥物靶基因的研究是開發(fā)新藥最重要的一個組成部分，研究人員可以根據預測的靶基因設計并合成作用化合物．隨后進行有關實驗，可以有效節(jié)約新藥開發(fā)的時間經濟成本[29]．藥物靶基因預測的另一個應用方面是藥物重新審視定位[28]，通過預測靶基因挖掘已知靶向藥物．盡管這些靶向藥物原本被用于治療其他疾病，但對它們進行篩選、修飾或許能夠發(fā)現其具有治療AD的新用途[30]．

綜上所述，本研究預測得出的靶基因以及可潛在用于治療AD的藥物，將為AD的臨床藥物治療提供更多的選擇，也為后續(xù)的藥物開發(fā)提供新思路和線索．

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