郟愛華，金健，王彥秋，彭慧芳

河南科技大學第一附屬醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2神經(jīng)分子實驗室，河南 洛陽 471000

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有早期發(fā)病隱匿、進展速度快等特點，其發(fā)病率和病死率在全部婦科腫瘤中位居前列[1]。卵巢癌細胞惡性增殖、凋亡減少是卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)，而卵巢癌的發(fā)病機制較為復雜，癌基因過度表達、抑癌基因表達缺失是卵巢癌發(fā)生的關(guān)鍵[2]。Xklp2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）與微管蛋白有關(guān)，在生物機體細胞中心體的功能發(fā)揮中具有重要作用，其在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤組織中的表達水平高于正常組織[3-4]。有研究顯示，TPX2參與膀胱癌、宮頸癌等腫瘤細胞的增殖與調(diào)控，在腫瘤細胞的增殖過程中發(fā)揮促進作用，下調(diào)TPX2表達可以抑制腫瘤細胞的增殖[5-6]。目前，關(guān)于TPX2表達下調(diào)對卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響尚不明確，本研究以卵巢癌細胞為研究對象，通過細胞轉(zhuǎn)染TPX2小干擾RNA下調(diào)細胞中TPX2的表達，并通過MTT比色法、細胞克隆實驗等方法明確TPX2表達下調(diào)對卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響，以期為研究卵巢癌的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞

卵巢癌細胞SKO-V3購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time-PCR，qRT-PCR）試劑盒購自大連Takara生物工程公司；；cDNA合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）單克隆抗體購自美國Epitomic公司；TPX2單克隆抗體購自美國Santa公司；TPX2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由南京金斯瑞公司合成；TPX2 siRNA和siRNA control購自英國Abbexa公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)公司；信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體購自美國Abacm公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體購自美國Sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細胞分組及培養(yǎng)

SKO-V3采用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。SKO-V3濃度約為60%時，在細胞中轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA和siRNA control，分別作為干擾組和陰性組，同時以不作轉(zhuǎn)染的細胞作為對照組。各組細胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h后，分別采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達水平，步驟見1.4.1和1.4.2。

1.4 實驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測 對照組、陰性組和干擾組細胞在轉(zhuǎn)染后48 h，采用Trizol法提取細胞中的RNA，步驟按照RNA提取試劑盒說明書操作。提取的RNA使用無核糖核酸酶水溶解，保存在-80℃溫度下。吸取RNA樣品，采用微量核酸定量儀測定波長為260 nm和波長為280 nm時光密度（optical density，OD）的比值，比值范圍為1.8～2.0說明提取的RNA質(zhì)量較好。使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，步驟參照試劑盒說明書進行操作。采用qRT-PCR技術(shù)檢測TPX2 mRNA的水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對定量法計算，用2-△△Ct計算TPX2 mRNA的水平。TPX2上游引物為5'-ACCTTGCCCTACTAAGATT-3'，下 游 引 物 為 5'-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3'。GAPDH上游引物為 5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3-3'，下游引物為5'-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3'。PCR反應(yīng)體系按試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共進行40個循環(huán)。實驗重復3次，取均值。

1.4.2 Western blot檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，對照組、陰性組和干擾組提取細胞總蛋白，步驟參照蛋白濃度提取試劑盒說明書進行操作，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品和上樣緩沖液混合后于100℃煮沸5 min。采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳。每孔中添加40 μg蛋白，在110 V條件下電泳2 h。取出凝膠，在90 V、4℃的條件下把蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。封閉：5%胎牛血清白蛋白，室溫孵育60 min。一抗孵育：將NC膜放置在1∶900稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。二抗孵育：將NC膜放置在1∶3000稀釋的二抗中，室溫條件下反應(yīng)1 h。DAB顯色，曝光后，用Quantity one分析目的條帶及內(nèi)參GAPDH的灰度值。目的蛋白水平=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復3次，取均值。

1.4.3 MTT比色法實驗 將對照組、陰性組和干擾組細胞接種到96孔板中，每個孔中加入3000個細胞，100 μl細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)5個重復孔，孵育48 h。在每個孔中添加MTT溶液20 μl，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，將孔內(nèi)的液體吸除干凈后，每個孔中添加150 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育振蕩反應(yīng)10 min，用全自動酶標儀檢測492 nm處的OD值。實驗重復3次，取均值。

1.4.4 平板克隆實驗 將對照組、陰性組和干擾組細胞種植到平皿中，于每個平皿中加入200個細胞，細胞液體積為10 ml，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h后，肉眼可以觀察到細胞克隆出現(xiàn)，采用4%的多聚甲醛固定，吉姆薩染色后，干燥，計算克隆形成數(shù)目和克隆形成率。實驗重復3次，取均值?？寺⌒纬陕?（克隆形成數(shù)目/接種細胞總數(shù)）×100%。

1.4.5 流式細胞術(shù)檢測 對照組、陰性組和干擾組細胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，收集各組細胞，在細胞中加入冰預冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗細胞后，與500 μl結(jié)合緩沖液混勻，再加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μl，在避光、室溫條件下孵育20 min。立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次，取均值。

1.4.6 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平檢測 對照組、陰性組和干擾組的細胞培養(yǎng)48 h后，提取細胞蛋白，采用Western blot法檢測細胞中 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白的表達水平。Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值；p-STAT3以STAT3為內(nèi)參，計算p-STAT3/STAT3比值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA后細胞中TPX2 mRNA、TPX2蛋白的表達水平

轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA后，對照組、陰性組和干擾組細胞中TPX2 mRNA的表達水平分別為（1.00±0.12）、（1.02±0.09）、（0.21±0.02），3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=225.988，P﹤0.05）；對照組、陰性組和干擾組細胞中TPX2蛋白的表達水平分別為（1.15±0.13）、（1.13±0.12）、（0.36±0.04），3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=55.505，P﹤0.05）。陰性組與對照組細胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。干擾組細胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（圖1）

圖1 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后3組細胞中TPX2的表達

2.2 下調(diào)TPX2對細胞增殖和克隆形成能力的影響

對照組、陰性組和干擾組細胞的OD值分別為（0.85±0.06）、（0.84±0.08）、（0.46±0.05），3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.592，P﹤0.01）；對照組、陰性組和干擾組的細胞克隆形成率分別為（41.36±0.42）%、（40.69±0.51）%、（26.54±0.22）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1300.177，P﹤0.01）。陰性組與對照組細胞的OD值和克隆形成率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。干擾組細胞的OD值和克隆形成率均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。

2.3 下調(diào)TPX2對細胞凋亡的影響

對照組、陰性組和干擾組的細胞凋亡率分別為（9.24±0.84）%、（9.32±0.80）%、（33.51±3.12）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=158.962，P﹤0.01）。陰性組與對照組的細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。干擾組的細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（圖2）

圖2 下調(diào)TPX2對細胞凋亡的影響

2.4 下調(diào)TPX2對細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平的影響

對照組、陰性組和干擾組細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA和 p-STAT3/STAT3蛋白的表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。陰性組與對照組細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。干擾組細胞中Cleaved Caspase-3水平明顯高于對照組，而Bcl-2、PCNA、p-STAT3/STAT3水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（圖3、表1）

圖3 下調(diào)TPX2對細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平的影響

3 討論

TPX2在哺乳動物微管相關(guān)蛋白的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用，能夠作用于著絲粒，從而影響微管的形成、組裝及細胞的有絲分裂[7]。近年來的研究顯示，非小細胞肺癌細胞染色體20q11.2持續(xù)擴增導致TPX2的表達水平升高，同樣在胰腺導管癌中發(fā)現(xiàn)TPX2 mRNA和TPX2蛋白過度表達，推測TPX2可能是腫瘤治療和診斷的潛在靶點[8-9]。在膀胱癌細胞T24中抑制TPX2表達后，膀胱癌細胞的增殖速度降低，并且細胞的凋亡率升高，細胞中Caspase的活化水平也提高[10]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TPX2表達后，卵巢癌細胞的增殖和克隆形成能力均下降，而細胞凋亡率升高，說明下調(diào)TPX2表達可以發(fā)揮抑制卵巢癌細胞增殖的作用，誘導卵巢癌細胞凋亡。

表1 下調(diào)TPX2后各組細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平的比較（±s）

表1 下調(diào)TPX2后各組細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平的比較（±s）

組別對照組陰性組干擾組F值P值Bcl-2 0.95±0.08 0.93±0.12 0.21±0.03 73.714 0.000 Cleaved Caspase-3 0.40±0.06 0.41±0.07 1.04±0.10 65.400 0.000 PCNA 0.74±0.08 0.75±0.07 0.26±0.03 57.861 0.000 p-STAT3/STAT3 0.85±0.06 0.84±0.04 0.13±0.02 273.911 0.000

細胞的增殖與凋亡是一個復雜的過程，受多種基因的嚴格調(diào)控，是細胞內(nèi)多種因子共同作用的結(jié)果[11]。Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與細胞凋亡，是目前研究較為透徹的與細胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其含有多個蛋白成員，根據(jù)其作用的不同可以分為凋亡起始因子、執(zhí)行因子等，其中，Caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，其活化形成Cleaved Caspase-3后，標志著細胞凋亡進入不可逆的階段[12]。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成員，其表達水平升高后可以抑制細胞凋亡的發(fā)生[13]。PCNA存在于增殖細胞中，與細胞內(nèi)的DNA合成有關(guān)，其表達水平的高低可以反映細胞的增殖狀態(tài)[14]。有研究顯示，卵巢癌組織中Bcl-2水平升高，Cleaved Caspase-3水平降低，PCNA水平升高，PCNA、Caspase-3水平的高低與卵巢癌細胞的增殖和凋亡有關(guān)[15-16]。本研究顯示，下調(diào)TPX2后的卵巢癌細胞中PCNA和Bcl-2水平下降，細胞中Cleaved Caspase-3水平升高，說明下調(diào)TPX2可能通過誘導Caspase-3活化、抑制Bcl-2表達從而誘導卵巢癌細胞凋亡，通過降低PCNA的表達水平抑制卵巢癌細胞的增殖。

細胞內(nèi)存在多種信號轉(zhuǎn)導通路，這些信號轉(zhuǎn)導通路在細胞正常生物學特性的發(fā)揮中具有重要作用[17]。STAT3信號通路在生命體正常的組織和器官中均有表達，其磷酸化水平升高后可以促進細胞的增殖，減少細胞的凋亡[18]。在卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路過度激活，阻斷STAT3信號通路后可以誘導腫瘤細胞凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TPX2表達可以阻斷STAT3的磷酸化，抑制STAT3信號通路的激活，這提示下調(diào)TPX2表達可能通過抑制STAT3信號通路的激活從而誘導卵巢癌細胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)TPX2表達可以降低卵巢癌細胞的增殖和克隆形成能力，誘導卵巢癌細胞凋亡，誘導細胞中Caspase-3活化，抑制細胞中Bcl-2、PCNA的表達和STAT3信號通路的激活。TPX2可能是治療卵巢癌的潛在靶點，這為卵巢癌發(fā)病機制的研究奠定了基礎(chǔ)，但對于其具體的作用機制仍然需要進一步深入的探討。

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