常國濤，楊玉倫，宋國趁，萬清廉

鄭州人民醫(yī)院胸外科，鄭州 450000

食管癌是一種常見的食管鱗狀上皮或腺上皮發(fā)生病變的消化道惡性腫瘤。2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國食管癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)大約分別為47.8萬和37.5萬，占全國惡性腫瘤的11.1%和13.3%[1]。食管癌根據(jù)組織病理學(xué)分為食管腺癌和食管鱗癌，其中食管鱗癌在中國占90%左右。食管癌的惡性程度較高，早期病情隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。目前，針對(duì)食管癌的治療以外科手術(shù)治療和放化療為主，但往往出現(xiàn)預(yù)后效果差和生存率低等現(xiàn)象。微小RNA（miRNA）是一類可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，不僅與多種腫瘤疾病的診斷、預(yù)后和治療密切相關(guān)，還可以作為致癌或抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為[2-4]。食管癌的發(fā)生是一個(gè)多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，由于治療手段的局限性，miRNA對(duì)食管癌的治療越來越受到關(guān)注和重視。近年來的研究顯示，miRNA-183在多種腫瘤中異常表達(dá)，通過不同的作用機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等生理過程[5-7]。目前，關(guān)于miRNA-183在食管癌中的作用機(jī)制尚未完全清楚。本文研究了miRNA-183對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在了解食管癌的發(fā)病機(jī)制，并為食管癌的診斷和治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2012—2017年于鄭州人民醫(yī)院接受食管癌切除術(shù)并經(jīng)病理檢查確診的食管鱗癌患者96例。手術(shù)切除時(shí)均經(jīng)患者同意，取其食管癌組織及距離癌組織5 cm以外的正常食管組織?；颊咝g(shù)前均無放療或化療史。96例患者中，男62例，女34例；年齡43～76歲，平均（62.35±5.22）歲。正常食管上皮細(xì)胞株HEEC和食管鱗癌細(xì)胞株Eca109由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、Lipofectamine 2000和Trizol均購自美國Gibico公司；膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、熒光定量PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司 ；miRNA-183 inhibitor、miRNA-183 inhibitor negative control和PCR引物均購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）單克隆抗體、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、p53單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔IgG（IgG-HRP）二抗均購自上海Beyotime公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR檢測(cè) 取保存于液氮罐中的正常食管組織和食管癌組織，在預(yù)冷的研缽中研成粉末，取粉末40 mg置于含有1 ml Trizol的試管中，采用電動(dòng)勻漿器獲得勻漿，加入預(yù)冷的氯仿200 μl，充分反應(yīng)后，5000 rpm離心10 min。取上清液，加入等量異丙醇，反應(yīng)30 min后，以75%乙醇沉淀RNA。加入適量的無RNA酶的水溶解RNA，紫外吸收法檢測(cè)RNA的濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板鏈進(jìn)行熒光定量 PCR。每管反應(yīng)體系為 20 μl，其中模板 2 μl，上下游引物各 0.5 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 7 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸300 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-183的表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將正常食管上皮HEEC細(xì)胞和食管鱗癌Eca109細(xì)胞培養(yǎng)于含有青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長面積占培養(yǎng)瓶面積的70%以上時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶，使用培養(yǎng)液終止消化后，按照1∶4的比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的兩種細(xì)胞，按照1.2.1中的步驟檢測(cè)miRNA-183的表達(dá)情況。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染前1 d，收集對(duì)數(shù)生長期的食管鱗癌Eca109細(xì)胞，以1×106/ml的細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以加入脂質(zhì)體和miRNA-183 inhibitor的細(xì)胞為miRNA-183 inhibitor組，以加入脂質(zhì)體和miRNA-183 inhibitor negative control的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以加入等量脂質(zhì)體的細(xì)胞為空白對(duì)照組。其中，miRNA-183 inhibitor的終濃度為250 nmol/L。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞中miRNA-183的表達(dá)情況，操作步驟同1.2.1。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集上述融合度為70%以上的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入結(jié)合緩沖液（binding buffer）500 μl重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，于避光條件下室溫反應(yīng)30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)Bcl-2和p53蛋白的表達(dá)水平 收集1.2.3中轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量總蛋白。將樣品蛋白與加樣緩沖液混合后，沸水浴3 min。取變性蛋白30 μg，上樣，先用8 V/cm電壓，待染料進(jìn)入10%的聚丙烯酰胺分離膠后，電壓增大至15 V/cm，電泳至染料抵達(dá)分離膠底部。電泳完成后，取下凝膠，采用半干式法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，洗膜后，置于封閉液中，4℃下封閉1 h。加入Bcl-2（1∶500稀釋）、p53（1∶200稀釋）和β-actin抗體（1∶1000稀釋），于4℃下孵育一抗過夜，洗膜后加入IgG-HRP二抗（1∶2000稀釋），室溫下孵育2 h，ECL顯影，采用圖像分析軟件分析Bcl-2和p53蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-183在食管癌及正常食管組織和細(xì)胞中的表達(dá)

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-183 inhibitor組細(xì)胞的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量分別為（0.98±0.15）、（0.86±0.22）和（0.16±0.22）?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（t=0.781，P﹥0.05）；miRNA-183 inhibitor組細(xì)胞的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.334，P﹤0.05）。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-183表達(dá)水平的比較

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌組織中miRNA-183的相對(duì)表達(dá)量為（0.769±0.089），高于正常食管組織的（0.402±0.057），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.015，P﹤0.05）。食管鱗癌Eca109細(xì)胞中miRNA-183的相對(duì)表達(dá)量為（1.95±0.45），高于正常食管上皮HEEC細(xì)胞的（1.06±0.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.909，P﹤0.05）。

2.3 干擾miRNA-183表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-183 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率分別 為（7.58±1.18）% 、（9.36±1.25）% 和（23.45±3.62）%。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.794，P﹥0.05）；miRNA-183 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.219，P﹤0.05）。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞的凋亡情況

2.4 干擾miRNA-183表達(dá)對(duì)Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-183 inhibitor組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，p53蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.074、6.971，P﹤0.05）；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的Bcl-2和p53蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.887、1.441，P﹥0.05）。（圖2、表1）

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果圖

表1 3組細(xì)胞中Bcl-2和p53蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 3組細(xì)胞中Bcl-2和p53蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05

空白對(duì)照組陰性對(duì)照組miRNA-183 inhibitor組F值P值Bcl-2 0.92±0.06 0.88±0.05 0.22±0.03*198.686＜0.01 p53 0.25±0.02 0.28±0.03 0.43±0.04*28.862＜0.01

3 討論

miRNA-183是miRNA-183家族中具有高度保守性的重要一員，位于人染色體7q32.3上。研究證實(shí)，miRNA-183與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及多種腫瘤的預(yù)后較差密切相關(guān)[8-9]。miRNA-183在多種腫瘤中呈高表達(dá)或低表達(dá)，而干擾miRNA-183表達(dá)后，可調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。Gu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-183在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯上升，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA-183 mimic和miRNA-183 inhibitor干擾miRNA-183表達(dá)后，證實(shí)miRNA-183在胃癌中發(fā)揮著致癌基因的作用。曾憲一等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-183在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中低表達(dá)，通過上調(diào)miRNA-183表達(dá)能夠明顯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲。細(xì)胞凋亡異常是多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。目前，食管癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確，探討食管癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，從而有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)食管癌的治療具有重要意義。為探討miRNA-183在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，本研究首先采用熒光定量PCR檢測(cè)食管癌及正常食管組織和細(xì)胞中miRNA-183的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-183在食管癌組織和細(xì)胞中均呈高表達(dá)，提示miRNA-183可能與食管癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA-183 inhibitor下調(diào)miRNA-183表達(dá)后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)食管鱗癌Eca109細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miRNA-183表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率升高，表明下調(diào)miRNA-183的表達(dá)可誘導(dǎo)食管鱗癌Eca109細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)程序性死亡清理多余細(xì)胞和受損細(xì)胞的重要方式。正常情況下，細(xì)胞凋亡在機(jī)體內(nèi)受到嚴(yán)格控制以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，一旦調(diào)控失衡，則會(huì)引起食管癌等疾病的發(fā)生。內(nèi)部線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體外膜釋放細(xì)胞色素c的過程中發(fā)揮著重要作用[12]。p53是一種公認(rèn)的抑癌基因，在抑制血管生成和DNA修復(fù)、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著細(xì)胞應(yīng)激和腫瘤抑制的重要作用[13]。研究表明，抗凋亡蛋白Bcl-2和突變型p53蛋白與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-183對(duì)Bcl-2和p53蛋白的表達(dá)有一定的調(diào)控作用。Lu等[17]采用miRNA-183調(diào)節(jié)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-183表達(dá)可導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)水平明顯下降。底建敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-183可能通過抑制p53蛋白的表達(dá)從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為探討miRNA-183在食管癌中的作用機(jī)制，本研究采用Western blot法檢測(cè)下調(diào)miRNA-183的表達(dá)對(duì)食管鱗癌Eca109細(xì)胞中Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miRNA-183表達(dá)后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，p53蛋白表達(dá)明顯升高，提示miRNA-183可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)p53蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miRNA-183在食管癌中呈高表達(dá)，可能在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有可能成為食管癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)。抑制miRNA-183表達(dá)可通過上調(diào)p53蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，為食管癌發(fā)生機(jī)制的研究及治療提供了新的參考依據(jù)。

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