李廣廣，馬 勇，郭 楊，戴國達，蔡建平，黃桂成△

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所， 南京 210029； 2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致中老年患者殘疾的主要原因之一[1]，它以軟骨破損、骨贅形成及滑膜炎性改變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)[2]。隨著人口老齡化的發(fā)展，OA將極大地加重社會醫(yī)療負擔(dān)[3-4]。OA的病因病機復(fù)雜多樣，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)難以準確闡明。目前對OA的治療以緩解疼痛、抗炎等控制癥狀為主，且長期服用會帶來諸多不良反應(yīng)[5]。中醫(yī)藥對OA治療具有療效全面和安全可靠的獨特優(yōu)勢。

蔡建平主任醫(yī)師從醫(yī)多年，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗創(chuàng)立經(jīng)驗方通絡(luò)治痹湯，該方具有祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)之功效[6]，臨證中常以該方加減治療膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)療效顯著[7]。為進一步研究該方的作用機制，本研究通過改良Hulth法構(gòu)建兔KOA模型[8-9]，觀察通絡(luò)治痹湯能否抑制KOA兔模型炎癥反應(yīng)并對軟骨產(chǎn)生的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康成年新西蘭白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供(許可證號SCXK(蘇)2012-0008，合格證號201611476)。依據(jù)隨機分配原則分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、藤黃健骨丸組(C組)及通絡(luò)治痹湯組(D組)各6只。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

蘇木素染液、伊紅染液，IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒(南京建成科技有限公司)；石蠟切片機(Leica，RM2245)；組織包埋機(Leica，EG1150H/C)；生物顯微鏡(Leica，：DM1000)。

1.3 模型建立

對A組的新西蘭白兔，打開關(guān)節(jié)腔后直接縫合。其余各組予以改良Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后連續(xù)5 d，慶大霉素0.4MU/d臀大肌肌注，預(yù)防感染。

1.4 藥物制備及干預(yù)處理

依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》劑量估換計算公式：dB=dA×KB/KA[10]，將成人每日服藥量(通絡(luò)治痹湯組成：紅花、地鱉蟲、地龍、獨活、川芎、白芥子、牛膝、徐長卿、五加皮、雞血藤；藤黃健骨丸，國藥準字Z20026563，均由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供)折算為實驗兔每日服藥量。將通絡(luò)治痹湯煎煮濃縮、藤黃健骨丸研磨溶于水，并定容為10 ml/kg·d-1。造模成功后，C組與D湯組分別給予10 ml/kg·d-1藥物溶液灌胃，A組與B組分別給予10 ml/kg·d-1生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評估級別 觀察實驗兔膝關(guān)節(jié)局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動以及關(guān)節(jié)腫脹情況，并應(yīng)用Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評估方法[11]予以評價。

1.5.2 大體形態(tài)及組織學(xué)觀察 治療結(jié)束后，解剖各組實驗兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍等。用刀片切取股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨，4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察后行Mankin’s評分[12]。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測 頸總動脈取血20 ml，靜置2 h后離心(4 ℃，2000 r /min，30 min)獲得兔血清，分裝于Eppendorf管中，-80 ℃保存。

耳緣靜脈麻醉后，沿右膝髕上囊剪開約0.5 cm切口，1 ml生理鹽水分3次灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液置于Eppendorf管中，離心(4 ℃，4000 r /min，10 min)后獲取上清液，-20 ℃ 保存。按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書分別檢測實驗兔血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β與TNF-α的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Lequesne MG行為學(xué)觀察

表1顯示，與A組比較其余各組Lequesne MG評分顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組及D組評分均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 新西蘭白兔Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評估級別

注：與假手術(shù)組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。Kruskal-Wallis分析結(jié)果：局部反應(yīng)=17.882，P=0.0009；步態(tài)改變=16.419，P=0.001；關(guān)節(jié)活動=16.480，P=0.001；關(guān)節(jié)腫脹=14.987；P=0.002

2.2 軟骨大體形態(tài)觀察

圖1所示，兔膝關(guān)節(jié)A組軟骨表面光滑，色澤明亮呈淡粉色，未見裂紋、纖維化及軟化等，軟骨邊緣整齊，無骨贅形成(圖A)；B組軟骨表面凹凸不平，色澤灰暗無光，可見局部裂紋及纖維化，軟骨邊緣毛糙，有骨贅形成(圖B)；C丸組軟骨表面略粗糙呈藍白色，內(nèi)外側(cè)髁處可見局部纖維化，內(nèi)側(cè)髁底部可見局部潰瘍，軟骨邊緣有輕微骨贅形成(圖C)；D組軟骨表面略毛糙，顏色介于淡粉色與藍白色之間，內(nèi)側(cè)髁處粗糙，外側(cè)髁不明顯，局部可見裂紋及軟骨軟化(圖D)。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨大體觀察圖注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藤黃健骨丸組；D.通絡(luò)治痹湯組

2.3 軟骨組織學(xué)觀察及Mankin’s評分

圖2顯示，A組軟骨表面光滑，細胞排列規(guī)則，層次有序，分布正常，染色正常，潮線清晰(圖A)；B組軟骨表面破損，軟骨層大片脫落未見軟骨，潮線模糊、斷裂(圖B)；C組軟骨面率粗糙，軟骨層小部分缺失，軟骨細胞群集現(xiàn)象減輕、排列輕微紊亂，潮線染色較淺，輕度失染(圖C)；D組軟骨面略毛糙，軟骨層局部修復(fù)，軟骨細胞局部群集、深染，潮線輕度模糊(圖D)。

表2顯示，軟骨組織Mankin’s評分顯示，與A組比較其余3組評分均明顯增高(P<0.05)，與B組比較，C組及D組評分均明顯下降(P<0.05)。

2.4 ELISA檢測IL-1β、TNF-α表達

表2顯示，對實驗兔血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β及TNF-α水平進行ELISA檢測后，與A組比較，其余3組的IL-1β及TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。血清中D組與B組比較，IL-1β及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，C組僅TNF-α水平較模型組有明顯改變(P<0.05)。而關(guān)節(jié)液中C組與D組的IL-1β及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色(100×)光鏡觀察圖注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藤黃健骨丸組；D.通絡(luò)治痹湯組

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分結(jié)果及ELISA檢測IL-1β、TNF-α水平比較

注：與假手術(shù)組比較：#P< 0.05；與模型組比較：*P< 0.05

3 討論

OA屬于中醫(yī)骨痹范疇?！端貑枴らL刺節(jié)論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！标P(guān)節(jié)疼痛、麻木不仁、難以屈伸是OA的常見表現(xiàn)。如《素問·痹論》：“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸?！辈探ㄆ秸J為“肝腎不足、經(jīng)絡(luò)痹阻”是OA的根本病機，但OA發(fā)病時患者疼痛難忍，嚴重影響生活質(zhì)量，因而標本兼治，以“祛風(fēng)除濕，化瘀通絡(luò)”為治則，擬方通絡(luò)治痹湯。方中地鱉蟲化瘀通絡(luò)、消腫止痛；獨活祛風(fēng)除濕、通痹止痛共為君藥；配川芎祛風(fēng)止痛、活血行氣；紅花活血通經(jīng)、祛瘀止痛；雞血藤養(yǎng)血活血補血、止痛舒筋活絡(luò)；五加皮祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋骨，四者共為臣藥。佐以徐長卿祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)通絡(luò)，白芥子豁痰利氣、散結(jié)通絡(luò)止痛，地龍通經(jīng)行絡(luò)，牛膝活血通經(jīng)、補肝腎、強筋骨，引諸藥下行，諸藥合用共奏祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)、培補肝腎之效，對OA患者關(guān)節(jié)僵硬、酸痛等癥狀有標本同治之妙。藤黃健骨丸是國醫(yī)大師劉柏齡教授多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)所制成的中藥復(fù)方制劑，在治療OA的臨床應(yīng)用中效果顯著，因而被選為陽性對照藥物。

關(guān)節(jié)軟骨的退化與損傷是導(dǎo)致OA發(fā)生的首要因素。OA發(fā)生時軟骨退化或損傷將改變軟骨表面，關(guān)節(jié)軟骨因而受力異常進而刺激軟骨細胞等發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-1β、TNF-α等[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織及滑液中，IL-1β、TNF-α水平明顯增高[14]。同時IL-1β與TNF-α是誘導(dǎo)軟骨細胞降解的始動因子，能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖(ADAMTS)等組織破壞酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨細胞肥大及細胞終末分化等細胞異化作用直接參與對軟骨的破壞[15]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，細胞的異化活動將導(dǎo)致細胞基質(zhì)重建，軟骨構(gòu)成物丟失，軟骨鈣化、龜裂并引起軟骨細胞增殖、群集，從而導(dǎo)致軟骨面更加粗糙，軟骨厚度變薄及纖維化[16]。因此課題組認為，關(guān)節(jié)軟骨退化與炎癥因子是OA發(fā)生的2個主要原因，且兩者互為因果，不斷刺激OA的發(fā)生發(fā)展，使病情持續(xù)惡化，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、功能障礙。

既往研究認為，OA的發(fā)生是由抗炎因子與促炎因子的失衡導(dǎo)致，局部組織中炎癥因子增多引起軟骨退變[17]，過多地肯定了炎癥因子的作用，而忽視了軟骨退變的作用。對炎癥因子與軟骨退變間的影響，往往認為是一方主導(dǎo)另一方的改變。

但實驗結(jié)果顯示，A組膝關(guān)節(jié)表面光滑未見裂紋、纖維化及軟化等，軟骨細胞排列有序，無異常群集或增殖；而造模8周后表面凹凸不平，局部可見裂紋及纖維化，軟骨細胞異常群集、排列無序；中藥干預(yù)后，局部逆轉(zhuǎn)軟骨的鈣化、纖維化等，改善軟骨細胞的異化作用。與此同時，B組實驗兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α水平顯著增高，而C組及D組水平明顯下降，且與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兔血清中IL-1β、TNF-α水平也表現(xiàn)出與關(guān)節(jié)液中相一致的結(jié)果，進而說明中藥復(fù)方具有多靶點、多機制的作用，能夠從整體著手調(diào)節(jié)人體的生理病理。以上研究結(jié)果表明，炎癥因子的表達量與軟骨面的改變存在一定的正向相關(guān)性。所以通過本實驗發(fā)現(xiàn)，軟骨面的改變與炎癥因子之間存在相互作用。軟骨面遭到破壞，導(dǎo)致血管、裂紋及微裂隙數(shù)量的增加，進而擾亂軟骨與軟骨下骨之間的分子交互作用。同時，炎性因子的活躍不斷刺激軟骨，導(dǎo)致軟骨鈣化、纖維化等，由此形成一個持續(xù)的“惡性循環(huán)”。

基于以上研究結(jié)果，筆者認為“通絡(luò)治痹湯”能夠抑制炎癥反應(yīng)，延緩軟骨退化，促進軟骨修復(fù)，改善關(guān)節(jié)生理功能。但本實驗仍存在一定的不足，對于其修復(fù)軟骨面的作用機制尚不清楚。故本課題組將在后續(xù)實驗中深入研究，并通過體外研究方式，找出“通絡(luò)治痹湯”的抗OA作用機制。

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