詹明，余晶波，楊軍

糖尿病及其并發(fā)癥在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升，已成為危害人類健康的主要疾病。糖尿病腎?。―N）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，是決定糖尿病患者預(yù)后的一個主要因素。高血糖環(huán)境可導(dǎo)致腎小球和腎小管間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)積聚，腎血管壁的增厚和透明化[1]。大量研究表明腎小管的損傷和腎小球病變同樣重要，且前者是預(yù)測DN疾病進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)[2]，然而目前仍缺少有效治療糖尿病腎小管病變的藥物。近期研究發(fā)現(xiàn)一種在腎小管中特異表達(dá)的蛋白，命名為肌醇加氧酶，它可將肌醇分解代謝為D-葡萄糖醛酸鹽以進(jìn)入戊糖磷酸途徑[3]。除了催化葡萄糖中介體的作用之外，肌醇加氧酶被證實和DN發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4]。體內(nèi)外實驗顯示高葡萄糖環(huán)境下，肌醇加氧酶的激活誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞的氧化損傷和死亡，從而引起DN的發(fā)展和惡化[5]。因此，尋找一種能抑制肌醇加氧酶的藥物將給DN的治療帶來新的希望。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，葡萄糖二酸鈣是肌醇加氧酶潛在的藥理學(xué)抑制劑[6]。該藥物被認(rèn)為具有腎臟保護(hù)作用，但對DN的治療作用和機(jī)制仍未知，相關(guān)文獻(xiàn)報道十分有限。因此，本研究通過建立DN大鼠模型，觀察葡萄糖二酸鈣對糖尿病大鼠腎臟的影響和藥物療效，并探討其作用的機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選用8周齡的SD大鼠30只作為實驗組，分為鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN加安慰劑組（STZ+安慰劑組）和STZ誘導(dǎo)的DN加2%葡萄糖二酸鈣治療組（STZ+藥物組），另留取10只大鼠作為正常對照組。通過每天向大鼠腹腔內(nèi)注射STZ（50 mg/kg）連續(xù)5 d誘導(dǎo)糖尿病狀態(tài)，注射后1周選擇血糖水平＞250 mg/dl的大鼠作為 DN大鼠模型開始進(jìn)行安慰劑或藥物治療，并在8周后處死。其中，2%葡萄糖二酸鈣為大鼠膳食食物中含質(zhì)量占2%的葡萄糖二酸鈣。

1.2 實驗方法 實驗組經(jīng)安慰劑或葡萄糖二酸鈣藥物治療8周后，取尾靜脈血通過Bioassay試劑盒進(jìn)行常規(guī)的血生化檢測，包括血糖水平，反映腎功能指標(biāo)的血清肌酐和血清尿素氮水平，同時留取大鼠尿液進(jìn)行尿微量白蛋白與尿肌酐比值（尿ACR）檢測。

在留取血液和尿液標(biāo)本后，處死大鼠，并取出腎臟組織分別制備石蠟標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。石蠟標(biāo)本制備通過將腎臟組織以4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋和切片，制成3m石蠟組織切片。切片進(jìn)行HE和PAS常規(guī)組化染色后，在光鏡下行腎臟的病理學(xué)檢查，并進(jìn)行定量評分。腎小球和腎小管損傷等級評分采用0～3分的腎臟形態(tài)損傷評分系統(tǒng)：0分為沒有腎小球/腎小管損傷；1分為＜25%的腎小球/腎小管損傷；2分為25%～50%的腎小球/腎小管受累；3分為50%及以上的腎小球/腎小管面積受累。此外，將石蠟組織切片進(jìn)行肌醇加氧酶的免疫組化染色，通過去抗原，孵育一抗二抗，DAB染色和蘇木素復(fù)染等步驟，觀察肌醇加氧酶在不同組中的蛋白表達(dá)水平差異。

用于電鏡的組織標(biāo)本以2.5%戊二醛固定，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片及染色等制備電鏡標(biāo)本，在透射電鏡下檢測。電鏡定位大鼠的近端腎小管上皮細(xì)胞，主要觀察不同組腎小管細(xì)胞中線粒體的動力學(xué)形態(tài)，測量線粒體的長度，＜1m為斷裂的線粒體，一個細(xì)胞若60%以上線粒體斷裂為線粒體斷裂細(xì)胞。統(tǒng)計發(fā)生上述線粒體斷裂的腎小管細(xì)胞數(shù)百分比。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標(biāo)比較 STZ+藥物組的血糖水平比 STZ+安慰劑組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而STZ+藥物組血肌酐、血尿素氮和尿ACR水平均顯著低于STZ+安慰劑組（均P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組腎臟病理損傷評分和線粒體斷裂指標(biāo)比較STZ+藥物組的腎小球損傷評分和腎小管損傷評分均顯著低于STZ+安慰劑組（均P＜0.05），且腎小管損傷的減輕程度更大；STZ+藥物組含線粒體斷裂腎小管細(xì)胞百分比低于STZ+安慰劑組（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組生化指標(biāo)比較

2.3 肌醇加氧酶蛋白表達(dá)水平比較 將未進(jìn)行干預(yù)的空白對照組和兩組實驗組的腎臟石蠟標(biāo)本行肌醇加氧酶免疫組化染色，并進(jìn)行蛋白表達(dá)水平比較。正常對照組的肌醇加氧酶表達(dá)水平很低，而STZ+安慰劑組的表達(dá)水平顯著升高，在STZ+藥物組中肌醇加氧酶表達(dá)水平較STZ+安慰劑組低。見封二彩圖1～3。

表2 兩組腎臟病理損傷評分和線粒體斷裂指標(biāo)比較

圖1 正常對照組腎臟肌醇加氧酶表達(dá)（IHC染色，×200）

圖2 STZ+安慰劑組腎臟肌醇加氧酶表達(dá)（IHC 染色，×200）

圖3 STZ+藥物組腎臟肌醇加氧酶表達(dá)（IHC 染色，×200）

3 討論

大鼠的糖尿病及其腎血管并發(fā)癥中都具有保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果顯示，葡萄糖二酸鈣具有治療DN的療效，且這一治療作用的機(jī)制可能是通過抑制肌醇加氧酶，從而部分恢復(fù)腎小管細(xì)胞線粒體異常形態(tài)，從而減少腎小管的氧化損傷和細(xì)胞凋亡。在大體病理上體現(xiàn)為腎小管損傷減輕，并通過管球反饋影響腎小球的病理改變。因此，本研究揭示了葡萄糖二酸鈣這一新型藥物對 DN動物的治療作用及其機(jī)制，提示該藥物具有良好的臨床應(yīng)用前景，并為今后的臨床藥物試驗奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。

近年來，DN以腎小球病變?yōu)橹鞯膫鹘y(tǒng)觀點已逐漸改變，研究熱點逐步轉(zhuǎn)移到了腎小管間質(zhì)損傷，且這種損傷被描述為“糖尿病腎小管病”[2]。在體內(nèi)外實驗中，靶向治療腎小管可明顯改善糖尿病引起的蛋白尿和腎功能情況，并延緩疾病的進(jìn)展，提示腎小管損傷和腎小球病變在DN的發(fā)病機(jī)制中同樣重要，且兩者具有協(xié)調(diào)作用[7]。因此，探索發(fā)現(xiàn)針對腎小管的藥物對有效治療DN十分必要，且具有很大的臨床實用價值。

既往研究已經(jīng)證明，肌醇加氧酶是一種特異性定位在腎小管的氧化還原調(diào)控蛋白，在高血糖環(huán)境下肌醇加氧酶的表達(dá)上調(diào)可以通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)節(jié)氧化還原失衡，并且可以誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，這必然會導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷和纖維化[4-5]。而近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)葡萄糖二酸鈣這一藥物對肌醇加氧酶的蛋白表達(dá)和活性有明顯抑制作用，且可以通過抑制肌醇加氧酶使線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常化，這一事實表明葡萄糖二酸鈣在治療DN方面具有很大的潛力[8]。

值得注意的是，葡萄糖二酸鈣是一種天然化合物，在西蘭花、菠菜及蘋果等蔬菜和水果中大量存在，其具有抗癌作用。每天補(bǔ)充葡萄糖二酸鈣這一活性成分具有較強(qiáng)的解毒和抗氧化功能，其主要作用機(jī)制可能是通過其增強(qiáng)機(jī)體對毒素和致癌物的解毒能力。此外，葡萄糖二酸鈣的衍生物近來已被報道在

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