王曉杰，劉曉蘭，叢萬鎖，鄭喜群，林巍

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米蛋白粉中約含62%～71%的蛋白質(zhì)，其主要組分是玉米醇溶蛋白(65%～68%)和谷蛋白(22%～33%)[1]。玉米醇溶蛋白是高憎水性蛋白，而玉米谷蛋白易溶于稀堿性溶液[2,3]，兩者水溶性差的特點(diǎn)嚴(yán)重限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，為了拓寬玉米蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用，需要對(duì)其進(jìn)行改性處理。

在食品工業(yè)中，蛋白質(zhì)的改性主要是采用美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)能夠顯著改善蛋白質(zhì)的加工性質(zhì)，如溶解性、乳化性、凝膠性等，以及抗氧化活性等生理功能特性[4-8]。然而，美拉德反應(yīng)存在反應(yīng)時(shí)間長，難以控制糖基化度，還會(huì)產(chǎn)生致突變物而存在安全隱患等缺點(diǎn)，所以隨著人們食品安全意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，需要研究一種比美拉德反應(yīng)更安全的方法來進(jìn)行食品蛋白質(zhì)的改性。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase, EC 2.3.2.13)能催化蛋白質(zhì)分子中谷氨酰胺殘基的γ-甲酰胺(氨基供體)和不同化合物的ε-氨基(氨基受體)之間異肽鍵的形成，屬于酰基轉(zhuǎn)移酶的范疇[9]。當(dāng)受體由含有伯胺基團(tuán)的糖提供時(shí)，如氨基葡萄糖等，則發(fā)生氨基糖與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，即發(fā)生了蛋白質(zhì)的酶法糖基化修飾。已有研究表明，TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)能夠改善蛋白質(zhì)的溶解性、流變學(xué)性質(zhì)、凝膠性和抗氧化等功能性質(zhì)[10-12]，并且其反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)條件比美拉德糖基化更溫和，不存在美拉德反應(yīng)中所存在的副反應(yīng)。

玉米蛋白含有高比例的谷氨酰胺殘基，且賴氨酸殘基含量少，因此，在含有伯胺基團(tuán)的糖的反應(yīng)體系中，TGase催化的糖基化反應(yīng)主要發(fā)生在玉米蛋白與供糖體之間，而發(fā)生在玉米蛋白之間的交聯(lián)反應(yīng)幾率低，因此玉米蛋白是酶法糖基化修飾的良好底物。目前為止，未見D-氨基半乳糖酶法糖基化修飾玉米醇溶蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用TGase催化D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白分子之間發(fā)生共價(jià)結(jié)合，優(yōu)化了糖基化反應(yīng)條件，對(duì)修飾產(chǎn)物的部分功能性質(zhì)進(jìn)行了研究，以表征糖基化修飾對(duì)玉米醇溶蛋白功能性質(zhì)的影響，為糖基化修飾玉米醇溶蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米蛋白粉：由中糧生化能源(龍江縣)有限公司提供。

1.2 試劑

微生物TGase：購自泰興市一鳴生物制品有限公司，酶活力1000 U/g；D-氨基半乳糖：購自上海御略化工有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)：購自Sigma公司；SDS-PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白、辣根過氧化物酶、鄰苯二甲醛：購自上海生工生物工程有限公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

SHZ-A型恒溫水浴振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PC/PLCLD-53型真空冷凍干燥機(jī) 美國Millrock公司；超低溫冰箱 美國熱電公司；TDL-5-A型離心機(jī)、DL-1型集熱式磁力加熱攪拌器 上海安亭科學(xué)儀器廠；pB-10型pH計(jì) 北京賽多利斯儀器有限公司；全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Buchi公司；RF-530型熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 玉米醇溶蛋白的提取

參照文獻(xiàn)[13]。

1.4.2 TGase催化玉米醇溶蛋白的糖基化反應(yīng)

將玉米醇溶蛋白按照一定底物濃度配制成懸浮液，然后加入D-氨基半乳糖混合均勻，加熱到一定溫度并用2 mol/L NaOH調(diào)整至合適的pH值，加入TGase開始糖基化反應(yīng)。對(duì)以下反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化：反應(yīng)初始pH 7.0，7.3，7.5，7.7，8.0，反應(yīng)溫度31，34，37，40，43 ℃，底物濃度1%，2%，3%，4%，5%，TGase添加量20，40，60，80，100 U/g蛋白，酰基供體與?；荏w的摩爾比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和反應(yīng)時(shí)間8，9，10，11，12 h。反應(yīng)結(jié)束后將樣品于85 ℃水浴中滅酶5 min，冷卻至室溫。用截?cái)喾肿恿?000 Da的透析袋于4 ℃條件下透析48 h，除去未反應(yīng)的D-氨基半乳糖，樣品經(jīng)冷凍干燥后備用。在相同反應(yīng)體系中，以不加D-氨基半乳糖制備交聯(lián)玉米醇溶蛋白。

1.4.3 糖基化修飾樣品中D-氨基半乳糖含量的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定糖基化修飾產(chǎn)物中D-氨基半乳糖的導(dǎo)入量(mg/g蛋白)。取0.01 g糖基化修飾后的玉米醇溶蛋白樣品于安瓿管中，加入2.5 mL 6 mol/L HCl，通過氮吹5 s排除管內(nèi)的空氣以防止氧化，用酒精噴燈灼燒安瓿管管口使其密封，放入100 ℃烘箱中酸水解8.0 h。取出樣品，冷卻后用濾紙過濾到10 mL的離心管中，吸取1 mL樣液，加入2 mL 3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，使pH值大于7.3，再從調(diào)節(jié)好pH值的樣液中取1.0 mL，加入1.0 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，冷卻后加入2 mL蒸餾水，混勻，測(cè)定500 nm處的吸光度值。帶入半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出修飾樣品中的D-氨基半乳糖的接入量。

1.4.4 SDS-PAGE法確認(rèn)玉米醇溶蛋白與殼寡糖發(fā)生糖基化反應(yīng)

具體方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.4.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物部分功能性質(zhì)的測(cè)定

1.4.5.1 溶解性

準(zhǔn)確稱量0.02 g糖基化修飾樣品(以蛋白基計(jì))以及對(duì)照樣品(玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白)，分別加入10 mL pH 2～12的緩沖溶液，漩渦混勻30 s后放置在4 ℃冰箱中過夜，使樣品充分水合。4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，收集上清液后測(cè)定在280 nm處的吸光度值。

1.4.5.2 表面疏水性

參照Kato和Nakai的方法[15]，略有改動(dòng)。稱取玉米醇溶蛋白和糖基化修飾產(chǎn)物樣品各0.3 g，分別加入30 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.0)，放在室溫下進(jìn)行溶解。24 h后蛋白質(zhì)樣品在10000 r/min的條件下離心10 min，用Folin-酚法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，然后用0.01 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.0)稀釋該上清液得到系列濃度(0.01～0.2 mg/mL)的蛋白質(zhì)溶液。取蛋白質(zhì)溶液4 mL，加入20 μL ANS(8 mmol/L，用pH 7.0，0.01 mol/L的PBS配制)，漩渦混勻，在室溫條件下避光反應(yīng)15 min。在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm以及狹縫5 nm的條件下，測(cè)定ANS結(jié)合物的相對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度，以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，以線性關(guān)系良好的回歸曲線的斜率表示表面疏水性。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-氨基半乳糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的條件優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)初始pH值對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度37 ℃、玉米醇溶蛋白的底物濃度3%、?；w與受體摩爾比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反應(yīng)時(shí)間8 h的條件下，研究反應(yīng)體系初始pH對(duì)玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖導(dǎo)入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)初始pH值對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.1 Effect of initial pH value on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖1可知，隨著pH值的增大，玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖的接入量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在pH值為7.5時(shí)，D-氨基半乳糖的接入量達(dá)到最大值，為7.04 mg氨基半乳糖/g蛋白；而當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，接糖量開始降低。pH值是影響D-氨基半乳糖穩(wěn)定性及TGase催化活力的一個(gè)重要因素。在弱酸條件下，由于D-氨基半乳糖分子中的氨基被質(zhì)子化多以-NH3+形式存在，影響了糖基的導(dǎo)入。在弱堿性條件下，雖然玉米醇溶蛋白的溶解性增強(qiáng)，但由于TGase催化活力降低和D-氨基半乳糖的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而導(dǎo)致玉米醇溶蛋白分子中糖基的導(dǎo)入量降低[16]。因此，選取糖基化反應(yīng)的最適初始pH值為7.5。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)初始pH 7.5、底物濃度3%、酰基供體與?；荏w摩爾比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反應(yīng)時(shí)間8 h的條件下，研究不同反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖接入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，接糖量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在37 ℃時(shí)，接糖量最大，達(dá)9.77 mg/g蛋白。當(dāng)糖基化溫度超過40 ℃時(shí)，接糖量逐漸降低。溫度對(duì)酶法糖基化反應(yīng)的影響主要是影響反應(yīng)速率常數(shù)和酶的催化作用，在較低的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度的增加而增加，從而酶的催化反應(yīng)速率增加，但超過一定溫度后，TGase因發(fā)生熱變性而影響其催化作用。因此，選擇最適的反應(yīng)溫度為37 ℃。

2.1.3 底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)初始pH 7.5、反應(yīng)溫度37 ℃、?；w與酰基受體摩爾比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反應(yīng)時(shí)間8 h的條件下，研究不同底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.3 Effect of zein concentration on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖3可知，隨著玉米醇溶蛋白濃度的增加，D-氨基半乳糖導(dǎo)入量總體呈先增加后減小的變化趨勢(shì)，在底物濃度為2%～4%范圍內(nèi)，糖基導(dǎo)入量的變化幅度較小。當(dāng)玉米醇溶蛋白濃度為3%時(shí)，糖基的導(dǎo)入量達(dá)到最大，為10.15 mg/g蛋白。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～2%范圍內(nèi)，隨著底物濃度的提高，底物濃度與酶促反應(yīng)速率成正比，從而有利于糖基的導(dǎo)入；但是，當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步增加，酶促反應(yīng)速率不再增加，表現(xiàn)為0級(jí)反應(yīng)，說明酶已被底物所飽和。但當(dāng)玉米醇溶蛋白的濃度增加到5%時(shí)，反應(yīng)體系中不溶性的顆粒太多，阻礙了反應(yīng)物的擴(kuò)散，使糖基化反應(yīng)的進(jìn)行受阻，接糖量下降。綜合考慮，選擇最適的底物濃度為3%。

2.1.4 D-氨基半乳糖添加量對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)初始pH 7.5、反應(yīng)溫度37 ℃、底物濃度3%、TGase添加量60 U/g蛋白、反應(yīng)時(shí)間8 h的條件下，研究?；w和?；荏w摩爾比即D-氨基半乳糖添加量對(duì)玉米醇溶蛋白中糖基接入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 D-氨基半乳糖添加量對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.4 Effect of D-galactosamine concentration on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖4可知，隨著D-氨基半乳糖添加量的增加，玉米醇溶蛋白中糖基的導(dǎo)入量呈先增加后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)D-氨基半乳糖添加量較低時(shí)(酰基供體與受體摩爾比為1∶1)，D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白分子碰撞的機(jī)率較小，因而D-氨基半乳糖的導(dǎo)入量較小。當(dāng)增大D-氨基半乳糖的添加量(?；w與受體摩爾比為1∶3)時(shí)，糖基的導(dǎo)入量達(dá)到最大，達(dá)10.74 mg/g蛋白。這是因?yàn)殡S著D-氨基半乳糖添加量的增加，蛋白質(zhì)分子與氨基糖分子之間的碰撞機(jī)率增加，有利于糖基化修飾反應(yīng)的進(jìn)行；繼續(xù)增加D-氨基半乳糖的添加量不會(huì)增加玉米醇溶蛋白的D-氨基半乳糖導(dǎo)入量，可能是位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制或空間位阻的影響，不利于糖基化修飾反應(yīng)的進(jìn)行。因此，選擇酰基供體與酰基受體的摩爾比為1∶3。

2.1.5 TGase添加量對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)初始pH 7.5、反應(yīng)溫度37 ℃、底物濃度3%、酰基供體與?；荏w的摩爾比1∶3、反應(yīng)時(shí)間8 h的條件下，研究不同TGase添加量對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 TGase添加量對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.5 Effect of TGase additive amount on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖5可知，隨著酶添加量的增加，D-氨基半乳糖的導(dǎo)入量呈先增加后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量為60 U/g蛋白時(shí)，糖基的導(dǎo)入量達(dá)到最大，為10.24 mg/g蛋白，再繼續(xù)增大TGase的添加量，D-氨基半乳糖的導(dǎo)入量呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。由米氏方程可知，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，酶促反應(yīng)速率與酶濃度成正比。但是，當(dāng)玉米醇溶蛋白分子上D-氨基半乳糖結(jié)合位點(diǎn)飽和之后，再繼續(xù)增加酶量，接糖量也不會(huì)再增加。同時(shí)，反應(yīng)體系中酶的濃度過高，加大了玉米醇溶蛋白分子自交聯(lián)的程度，形成的大分子多聚物的較大空間位阻減少了D-氨基半乳糖與底物結(jié)合位點(diǎn)接觸的機(jī)率，從而影響了玉米醇溶蛋白與糖基的交聯(lián)，因此，確定TGase的最適添加量為60 U/g蛋白。

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)初始pH 7.5、反應(yīng)溫度37 ℃、底物濃度3%、TGase添加量60 U/g蛋白、?；w和?；荏w摩爾比1∶3的反應(yīng)條件下，研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影響Fig.6 Effect of reaction time on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由圖6可知，隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長，玉米醇溶蛋白與D-氨基半乳糖的糖基化程度呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。在反應(yīng)10 h時(shí)，接糖量最大，即糖基化反應(yīng)時(shí)間最佳；低于10 h時(shí)，玉米醇溶蛋白與氨基半乳糖反應(yīng)不完全；大于10 h時(shí)，接糖量開始降低，分析有3個(gè)方面的原因：①反應(yīng)時(shí)間的延長，使TGase催化形成蛋白-蛋白交聯(lián)大分子和蛋白-糖多聚物的可能性加大，造成空間位阻大而阻礙了糖基的導(dǎo)入；②隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長，TGase的催化活力逐漸降低，酶促反應(yīng)速度降低；③反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，底物不足，影響了酶促反應(yīng)的進(jìn)行。所以，選擇D-氨基半乳糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 h。

2.2 D-氨基半乳糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE電泳

以玉米醇溶蛋白和糖基化修飾玉米醇溶蛋白為樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)制備2塊凝膠，一塊進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)染色，一塊進(jìn)行希夫試劑糖蛋白染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 玉米醇溶蛋白及D-氨基半乳糖修飾玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE profiles of zein and modified zein

注：A為蛋白質(zhì)染色，B為糖染色；泳道1為玉米醇溶蛋白；泳道2為D-氨基半乳糖糖基化玉米醇溶蛋白。

由圖7A可知，玉米醇溶蛋白含有3個(gè)主要組分，分別是分子量為45000 Da的聚合物、分子量為23930 Da和21968 Da的α-玉米醇溶蛋白組分。在糖基化修飾樣品中，同樣含有3個(gè)組分，且顏色的深淺程度也與原樣玉米醇溶蛋白相同。由圖7B可知，玉米醇溶蛋白被希夫試劑染成粉紅色，說明玉米醇溶蛋白本身含有糖類，分析這部分糖可能是原料在進(jìn)行去淀粉時(shí)產(chǎn)生的，以非共價(jià)鍵形式吸附在玉米醇溶蛋白分子上，而且這部分糖通過透析的方法不能被除去。經(jīng)糖基化修飾后，α-玉米醇溶蛋白條帶的顏色比原玉米醇溶蛋白深，說明糖蛋白的含量增加，但由于D-氨基半乳糖的分子量僅有215 Da，與玉米醇溶蛋白共價(jià)結(jié)合后對(duì)玉米醇溶蛋白分子量的變化影響較小。另外，在圖7B中沒有出現(xiàn)大分子量的分子內(nèi)交聯(lián)組分，可能是由于玉米醇溶蛋白分子中賴氨酸含量低，所以玉米醇溶蛋白分子發(fā)生的分子內(nèi)交聯(lián)的幾率低，沒有檢測(cè)到。因此，SDS-PAGE結(jié)果證實(shí)了D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白共價(jià)結(jié)合形成了糖蛋白。

2.3 D-氨基半乳糖糖基化修飾對(duì)玉米醇溶蛋白部分功能性質(zhì)的影響

2.3.1 D-氨基半乳糖糖基化修飾對(duì)玉米醇溶蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)一個(gè)重要的功能特性，在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、加工過程中有非常重要的作用。玉米醇溶蛋白因其在水中的溶解性不佳導(dǎo)致其在生產(chǎn)加工中受阻，本實(shí)驗(yàn)的目的是利用D-氨基半乳糖的溶解性改善玉米醇溶蛋白在水中的溶解性。以原玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白為雙對(duì)照，在蛋白質(zhì)濃度為2 mg/mL條件下，研究不同pH條件下玉米醇溶蛋白樣品的溶解性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 玉米醇溶蛋白及其修飾樣品的溶解性Fig.8 The solubility of zein and its modified products

由圖8可知，在pH 2～12范圍內(nèi)，玉米醇溶蛋白的溶解性較小。隨著pH值的增大，玉米醇溶蛋白溶液在280 nm處的吸光值呈先降低后增大的變化趨勢(shì)，在pH值為12時(shí)，溶液在280 nm處的吸光值為0.144。玉米醇溶蛋白在堿性條件下(pH 8～11)的溶解性高于酸性條件下的溶解性，且在pH 7.0時(shí)溶解度最低，推測(cè)為玉米醇溶蛋白的等電點(diǎn)。與玉米醇溶蛋白相比，糖基化修飾玉米醇溶蛋白的溶解性顯著提高，尤其是在pH 7.0時(shí)，280 nm處的吸光值增加了0.478，這是由于D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白共價(jià)結(jié)合后，糖鏈中親水性羥基的引入，增加了蛋白質(zhì)的親水性，因而玉米醇溶蛋白的溶解性增加。一些研究表明，糖基化修飾能夠改善蛋白質(zhì)的溶解性，Jiang等利用TGase的催化作用，將氨基葡萄糖導(dǎo)入酪蛋白和大豆分離蛋白，均改善了蛋白質(zhì)的溶解性。玉米醇溶蛋白交聯(lián)樣品的溶解性與玉米醇溶蛋白相差不多，可能是由于玉米醇溶蛋白幾乎不含有賴氨酸，在TGase存在下發(fā)生在玉米醇溶蛋白分子間的交聯(lián)反應(yīng)較少，所以對(duì)其溶解性影響較小。

2.3.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表面疏水性

疏水性在蛋白質(zhì)構(gòu)象及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等方面具有重要的作用，并且被認(rèn)為與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。以玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白為雙對(duì)照，對(duì)糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表面疏水性Table 1 The surface hydrophobicity of zein and its modified products

注：不同大寫字母表示分析結(jié)果差異極顯著(P<0.01)。

由表1可知，與未修飾玉米醇溶蛋白相比，糖基化修飾玉米醇溶蛋白的表面疏水性下降了460.8，而交聯(lián)玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加了312.14，即糖基化修飾使玉米蛋白的表面疏水性下降，而交聯(lián)反應(yīng)使玉米蛋白的表面疏水性增加，這與Jiang和Song的報(bào)道結(jié)果相一致。糖基的導(dǎo)入會(huì)降低蛋白質(zhì)表面疏水性，這是由于當(dāng)D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白共價(jià)結(jié)合后，玉米醇溶蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，雖然會(huì)導(dǎo)致一些位于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，但是相對(duì)于多羥基的D-氨基半乳糖分子來說，糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性降低。交聯(lián)反應(yīng)使表面疏水性顯著增加的可能原因是TGase的作用導(dǎo)致了玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)伸展，使包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露出來，因而交聯(lián)玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加。

3 結(jié)論

由于玉米醇溶蛋白不溶于水且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以玉米醇溶蛋白為原料，采用酶法糖基化方式對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，以期利用D-氨基半乳糖的溶解性改善玉米醇溶蛋白的溶解性等功能性質(zhì)。SDS-PAGE法證實(shí)了D-氨基半乳糖共價(jià)結(jié)合到了玉米醇溶蛋白分子中。采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了玉米醇溶蛋白與D-氨基半乳糖的最適糖基化反應(yīng)條件。與玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白相比，糖基化修飾玉米醇溶蛋白的表面疏水性顯著降低，表明其溶解性改善和體外消化性均明顯改善。在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步研究糖基化修飾對(duì)玉米醇溶蛋白的生理活性和加工特性的影響，以期達(dá)到提高玉米醇溶蛋白的營養(yǎng)性和功能性的效果，使其應(yīng)用范圍更加廣泛。

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