邊名鴻，傅彬，左勇，葉碧霞，楊小龍，張晶

(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

近年來，食品安全事件頻發(fā)，消費(fèi)者的食品安全感也越來越低，甚至導(dǎo)致公眾嚴(yán)重的心理恐慌[1]。合成色素的違規(guī)添加是造成食品安全問題的重要因素之一，而色調(diào)自然、安全性高且具有較高生理及藥理作用的天然色素[2-6]，正逐漸受到人們的青睞。在歐洲等發(fā)達(dá)國家的食用色素中，天然色素已占有85%以上的份額，而我國每年生產(chǎn)的食用色素中90%為天然色素[7]。目前，國際市場上天然色素的銷售額正在以10%的速度增長，市場需求巨大，且需求量逐年上升，各國爭相開發(fā)生產(chǎn)，然而目前我國天然食用色素的開發(fā)生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代化工業(yè)發(fā)展的需要[8]，研究開發(fā)天然色素有著廣闊的市場前景。

一直以來，天然色素主要以植物色素為主，但其原料受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的限制，且成本較高、質(zhì)量不易控制等因素導(dǎo)致植物色素的產(chǎn)量及市場應(yīng)用受到制約。而微生物色素能很好地克服植物色素的上述缺點(diǎn)，且已有成功先例[9]。微生物色素的生產(chǎn)將是解決植物色素產(chǎn)量低、成本高的有效途徑[10]。

與合成色素相比，大多數(shù)天然色素的穩(wěn)定性較差，容易受到光照、溫度、金屬離子、氧化劑等因素的影響而導(dǎo)致其褪色，這是天然色素的應(yīng)用受到阻礙的重要原因之一[11,12]。色素結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)的改變是導(dǎo)致其褪色的主要因素，探究色素結(jié)構(gòu)，對闡明色素褪色原理、指導(dǎo)護(hù)色研究有著重要意義。

本文對一種細(xì)菌紅色素的穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究，探究pH、溫度、光照、金屬離子、氧化劑、還原劑、常用食品添加劑等對該紅色素穩(wěn)定性的影響，并對該紅色素官能團(tuán)及分子量等進(jìn)行研究，以期為該紅色素的進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料及儀器

1.1 菌株

類芽孢桿菌(PaenibacillusagaridevoransXF-105)：保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2014644。

1.2 主要儀器

PHS-3C酸度計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HLMJ-250恒溫恒濕箱 上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠；TG-16臺式高速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；NICOLET 6700傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；LC1100/MSD-VL液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅色素粗品的制備

1.3.1.1 產(chǎn)紅色素菌株的培養(yǎng)

種子液的制備：從斜面上挑取2環(huán)菌體，接種到裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中(12層紗布蓋封口)，28 ℃，150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液的制備：按照2%(V/V)的接種量將種子液接種到裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中(12層紗布蓋封口)，調(diào)節(jié)初始pH為7.0，28 ℃，150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。

1.3.1.2 紅色素的提取

移取40 mL發(fā)酵液到50 mL離心管中，10000 r/min離心10 min，收集菌體。以固液比為1∶10(W/V)的比例加入95%乙醇，50 ℃水浴2 h，10000 r/min離心，棄沉淀，得到紅色素乙醇溶液。

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮紅色素乙醇溶液，自然涼干后即得到紅色素粗品。

1.3.2 紅色素的溶解性測定

各取10 mL乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、去離子水、正丁醇，分別加入0.01 g的紅色素粗品。靜置3 h，10000 r/min離心10 min后棄沉淀，觀察紅色素的溶解情況。

1.3.3 紅色素最大吸收波長掃描

取適宜濃度的紅色素乙醇溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)對其進(jìn)行光譜掃描，以無水乙醇為空白對照，掃描波長范圍為200～800 nm，確定其最大吸收波長。

1.3.4 溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，將試管分別置于4，30，40，60，80，100 ℃水浴，每2 h測定1次吸光度。

1.3.5 pH對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，用2 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。避光靜置3 h后，測定其吸光度并觀察顏色變化。

1.3.6 光照對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別置于室內(nèi)、室外及紫外光照環(huán)境下，每隔一段時(shí)間測定樣品吸光度。

1.3.7 常用酸對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的量添加蘋果酸和檸檬酸。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.8 氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

稱取一定量紅色素粗品，配制成母液，分別移取1 mL母液到10 mL容量瓶中，分別按照濃度為1%，2%，3%，4%，5%的量添加H2O2(濃度為30%)，以95%乙醇定容。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.9 還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的量添加Na2SO3和抗壞血酸。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.10 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為1，2，3，4，5 g/dL的量添加葡萄糖、蔗糖及苯甲酸鈉，避光靜置24 h后，測定其吸光度。

1.3.11 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液到試管中，分別加入BaCl2，LiCl，F(xiàn)eSO4，CaCl2，MnCl2，MgSO4，KCl，NaCl，使其濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.12 紅色素的分離及純化

大孔樹脂的預(yù)處理(X-5型)：稱取5 g大孔樹脂(X-5型)，采用2倍體積95%乙醇浸泡24 h，后用去離子水洗滌至流出液不渾濁且無異味。

利用柱層析對紅色素進(jìn)行分離純化。以X-5型大孔樹脂為固定相，采用乙酸乙酯-乙醇混合溶液洗脫(乙醇∶乙酸乙酯為1∶1)，層析柱口徑與柱長比為1∶40(V/V)，上樣條件參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，放置在通風(fēng)櫥自然干燥。

1.3.13 硅膠薄層層析

取2塊硅膠薄層層析板(5 cm×10 cm)，放置在烘箱中105 ℃，活化30 min，取出后放置在干燥皿中自然冷卻后，用2B鉛筆分別在距離兩端1 cm處畫2條直線(中間間隔8 cm)。

將1.3.12分離后的得到的紅色素溶液點(diǎn)樣在活化后的硅膠薄層層析板上(其中一條直線上)，以不同層析液展開，觀察有色條帶情況，分析純化后的紅色素有色組分。

1.3.14 紅外光譜掃描

將上述1.3.12分離后得到的紅色素溶液干燥后，用無水乙醇重新溶解并送至四川理工學(xué)院分析測試中心進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.3.15 紅色素質(zhì)譜檢測

將薄層層析(1.3.13中)后的紅色素從層析板上刮下，用甲醇溶液溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后送至四川理工學(xué)院分析測試中心經(jīng)高效液相色譜進(jìn)一步純化后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

分析柱流動(dòng)相甲醇∶水為4∶1，流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。紫外檢測波長為503 nm。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用ESI-MS對紅色素進(jìn)行檢測，質(zhì)量數(shù)掃描范圍110～1000，離子化模式：負(fù)態(tài)ES，毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：30 V；碰撞能：3 V。

2 結(jié)果及分析

2.1 紅色素的溶解性

取0.01 g紅色素粗品，加入10 mL不同溶劑，靜置3 h，觀察紅色素溶解情況，結(jié)果見表1。

表1 紅色素溶解情況Table 1 The solubility analysis of the red pigment

注：“+”表示可溶，“-”表示不溶或微溶。

由表1可知，該紅色素能溶解在乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇中，不溶于水以及正丁醇，說明該紅色素為脂溶性色素。

2.2 紅色素的全波長掃描

利用紫外分光光度計(jì)對紅色素乙醇溶液進(jìn)行全波長掃描，掃描結(jié)果見圖1。

圖1 紅色素的全波長掃描Fig.1 The full wavelength scanning map of the red pigment

由圖1可知，該紅色素乙醇溶液在波長為503 nm處有最大吸收峰且沒有其他明顯的吸收峰。說明該紅色素在乙醇溶液中的最大吸收波長為503 nm。

2.3 溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響

將相同濃度的紅色素乙醇溶液置于不同溫度條件下，探究溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of the temperature on the stability of the red pigment

由圖2可知，在設(shè)定溫度下4 h內(nèi)該紅色素都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性；80，100 ℃溫度下，超過4 h后，OD值下降較為明顯，但顏色變化較小。說明該紅色素在較高的溫度環(huán)境下，短時(shí)間內(nèi)其穩(wěn)定性較好，隨著時(shí)間的延長，紅色素穩(wěn)定性也逐漸降低。

2.4 pH對紅色素穩(wěn)定性的影響

將不同pH的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h后測定其OD503并觀察其顏色變化情況，探究pH對紅色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表2。

表2 pH對紅色素穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of the pH on the stability of the red pigment

由表2可知，當(dāng)pH在3～12范圍內(nèi)紅色素乙醇溶液的OD503均差異不大，且肉眼觀察紅色素顏色也無明顯變化。說明pH對該紅色素穩(wěn)定性的影響較小，該紅色素在酸性、中性及堿性環(huán)境下均保持良好的穩(wěn)定性。

2.5 光照對紅色素穩(wěn)定性的影響

將濃度相同的紅色素乙醇溶液放置在室內(nèi)、室外自然光及紫外光照射環(huán)境下處理，以探究不同光照對紅色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 日光及紫外照射對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of sunshine and UV irradiation on the stabilityof the red pigment

由圖3可知，在室外強(qiáng)光照射下紅色素的穩(wěn)定性最差，照射2 h紅色素幾乎完全褪色。紫外光照射8 h，紅色素的損失率達(dá)到了62.18%，在室內(nèi)散射光照射下，該紅色素的OD503變化不大。說明該紅色素對自然散射光照穩(wěn)定性較好，而對強(qiáng)自然光及紫外光照穩(wěn)定性較差，可能是因?yàn)槎滩ㄩL光對紅色素結(jié)構(gòu)的破壞作用較大，該紅色素不適宜在強(qiáng)光環(huán)境下使用。

2.6 常用酸對紅色素穩(wěn)定性的影響

將含有不同濃度的蘋果酸和檸檬酸的紅色素乙醇溶液，避光靜置3 h后測定OD503，以探究常用酸對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 常用酸對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of the acid on the stability of the red pigment

由圖4可知，隨著蘋果酸濃度的增加，紅色素的OD503逐漸降低，檸檬酸濃度越高，紅色素的OD503反而越大，但紅色素的OD503變化均不大。說明該紅色素對上述2種酸的穩(wěn)定性較好，且蘋果酸對紅色素有一定的破壞作用，檸檬酸對該紅色素有一定的護(hù)色作用。

2.7 氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

以H2O2為氧化劑，調(diào)節(jié)紅色素乙醇溶液H2O2濃度，避光靜置3 h，測定紅色素乙醇溶液的OD503，以研究氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of the oxidant on the stability of the red pigment

由圖5可知，隨著H2O2濃度的增加，紅色素乙醇溶液的OD503緩慢降低，且肉眼觀察紅色素溶液顏色差異不大，說明H2O2對紅色素穩(wěn)定性的影響較小，該紅色素對氧化劑較穩(wěn)定。

2.8 還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

將含有不同濃度抗壞血酸和亞硫酸鈉的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h后測定OD503，以探究還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of the reducing agent on the stability of the red pigment

由圖6可知，與空白比較，還原劑的添加對紅色素的穩(wěn)定性有一定影響，且隨著還原劑濃度的增加，紅色素的OD503有小幅度的下降，但肉眼觀察紅色素乙醇溶液的顏色沒有明顯變化。說明該紅色素對抗壞血酸和亞硫酸鈉均較穩(wěn)定。

2.9 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

將含有不同濃度葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉的紅色素乙醇溶液避光靜置24 h后測定OD503，以探究常有食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of the food additives on the stability of the red pigment

由圖7可知，隨著食品添加劑濃度的增加，紅色素OD503均有小幅度的下降趨勢，肉眼觀察紅色素乙醇溶液顏色無明顯變化，當(dāng)苯甲酸鈉濃度高于0.4 g/dL時(shí)，紅色素的OD503變化較明顯。說明該紅色素對蔗糖、葡萄糖以及苯甲酸鈉的穩(wěn)定性均較好，能夠與上述食品添加劑混合使用。

2.10 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響

將含有不同濃度各金屬鹽的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h，然后測定其OD503以探究金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of the metal ions on the stability of the red pigment

由圖8可知，隨著金屬離子濃度的增加，色素吸光值都有不同程度的下降，其中Mg2+，K+，Na+對紅色素吸光值基本沒有影響，Mn2+，Ca2+，Ba2+，F(xiàn)e2+等重金屬離子對紅色素都有不同程度的消色作用。其中Fe2+離子濃度低于0.3 g/L時(shí)，對紅色素穩(wěn)定性的影響不大，但當(dāng)其濃度高于0.3 g/L時(shí)，紅色素的OD503下降較快，且肉眼觀察紅色素乙醇溶液顏色變淺?？赡苁且?yàn)镕e2+有較強(qiáng)的還原性，導(dǎo)致紅色素的部分結(jié)構(gòu)被還原，從而導(dǎo)致紅色素褪色。

2.11 TLC結(jié)果

將紅色素乙醇溶液點(diǎn)樣在硅膠薄層層析板上，以不同層析液展開，試驗(yàn)結(jié)果見表3和圖9。

表3 薄層層析部分展開結(jié)果Table 3 TLC partially expanded results

圖9 紅色素的成分分離圖Fig.9 Composition separation diagram of red pigment

以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶乙醇為1∶1∶1為層析液，展開距離7.6 cm(總距離為8 cm)，Rf約為0.95，展開距離較大。以二氯甲烷∶乙酸乙酯為1∶1為層析液，展開距離為5.7 cm，Rf約為0.71，展開距離合適。由圖9可知，采用不同的層析液紅色素均有一條紅色條帶，說明經(jīng)純化后的紅色素成分較單一。

2.12 紅外光譜掃描

將純化后的紅色素，用乙醇溶解后，利用紅外光譜進(jìn)行掃描，試驗(yàn)結(jié)果見圖10。

圖10 紅色素的紅外光譜圖Fig.10 Infrared spectrogram of red pigment

2.13 紅色素質(zhì)譜分析

純化后的紅色素甲醇溶液，經(jīng)高效液相色譜進(jìn)一步純化后，采用質(zhì)譜檢測其分子量，試驗(yàn)結(jié)果見圖11。

圖11 紅色素的質(zhì)譜圖Fig.11 Mass spectrum of red pigment

細(xì)菌紅色素的負(fù)離子模式質(zhì)譜圖顯示[M-H]=339.1的準(zhǔn)分子離子峰，確定其相對分子質(zhì)量為340.1。

3 結(jié)論

參考文獻(xiàn)：

[1]王靜,孫寶國.食品添加劑與食品安全[J].科學(xué)通報(bào)，2013，58(26)：2619-2625.

[2]Chen Deming,Han Yonbin,Gu Zhenxin,et al.Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production byRhodobactersphaeroides[J].Process Biochemistry,2006,41:1773-1778.

[3]Chih-Hsiang Changa,Chi-Kang Tsaia,Tzu-Tai Leeb,et al.Targeted delivery of biosynthetic lycopene by the bacterial carrier[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2016,59:91-97.

[4]Giovannucci E.Tomatoes,tomato-based products,lycopene,and cancer: review of the epidemiologic literature[J].J Natl Cancer Inst,1999,91:317.

[5]張銳.紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的工藝優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(2):187-195.

[6]Rodrigues A L,Trachtmann N,Becker J,et a1.Systems metabolic engineering ofEscherichiacolifor production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein[J].Metabolic Engineering,2013,20(5):493-498.

[7]苗璇.食用天然色素研究應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景展望[J].化工管理,2013(5):5-9.

[8]呂幫玉,楊新河,毛清黎,等.我國天然食用色素的開發(fā)現(xiàn)狀與前景[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,19(10):108-110.

[9]Feng Yanli，Shao Yanchun，Chen Fusheng,et al.Monascuspigments[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,96:1421-1440.

[10]Dufossé L.Microbial production of food grade pigments[J].Food Technology and Biotechnology,2006,44:313-321.

[11]Onur Güneser.Pigment and color stability of beetroot betalains in cow milk during thermal treatment[J].Food Chemistry,2016,196:220-227.

[12]牛世全,韓彩虹,胡蛟龍,等.一株產(chǎn)藍(lán)色素放線菌的分離、鑒定及其色素穩(wěn)定性初步研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(1):134-137.

[13]范碧琴,杜靜君,趙桃,等.大孔樹脂分離純化洛神花花色苷的研究[J].食品工業(yè)科技,2015(1)：220-225.

[14]王昌祿,鄭傳寶,陳勉華,等.產(chǎn)粉紅色素紅曲霉M4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源,2010,32(2):26-29.