喬羽，于迪，范振宇，邢曉瑩，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 晉中 030801)

山西老陳醋是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵食醋，在其整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，微生物種類豐富，其生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生多種酶，對(duì)于山西老陳醋整個(gè)釀造過(guò)程至關(guān)重要。依據(jù)其催化機(jī)理分為淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等[1]。淀粉酶主要是利用原料中的淀粉生成葡萄糖；纖維素酶可將原輔料中的纖維素分解為微生物發(fā)酵可利用的糖，同時(shí)分解植物的細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)流出，更容易被微生物利用[2-7]；蛋白酶可以分解原輔料中的蛋白質(zhì)，供微生物生長(zhǎng)繁殖利用，同時(shí)也在一定程度上形成一些風(fēng)味物質(zhì)。因此，淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶對(duì)山西老陳醋的最終產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的影響。

芽孢桿菌能產(chǎn)生包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等在內(nèi)的多種酶類?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶的能力已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用[8,9]。芽孢桿菌在大曲和整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中始終存在，這可能是由于其極強(qiáng)的抗逆性[10,11]。因此產(chǎn)酶芽孢桿菌合理的應(yīng)用對(duì)提高老陳醋品質(zhì)具有重要意義。

本研究跟蹤山西老陳醋的發(fā)酵過(guò)程，從不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅中分離能夠產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的芽孢桿菌；篩選出高產(chǎn)酶的優(yōu)勢(shì)菌株。后續(xù)可將其應(yīng)用于山西老陳醋的發(fā)酵階段，為提高老陳醋的還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量及最終產(chǎn)品品質(zhì)提供寶貴的菌種資源基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)樣品

樣品：取自山西某醋廠；酒醪：山西某醋廠，發(fā)酵時(shí)間為1，4，7，10天；醋醅：發(fā)酵時(shí)間為1，3，5，7，9天。每個(gè)樣品3份，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

碘、碘化鉀、孔雀石綠、番紅、無(wú)水葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、L-酪氨酸、羧甲基纖維素納、剛果紅、氯化鈉、福林酚試劑、鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化鈉5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

淀粉水解培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、氯化鈉 5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[12]。

酪素培養(yǎng)基：分別配制A液和B液，A液：Na2HPO4·7H2O 1.07 g，干酪素5 g，加適量蒸餾水，并加熱溶解；B液：KH2PO40.36 g，加水溶解。A液和B液混合后加瓊脂20 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[13]。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.5 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、微晶纖維素粉1.88 g、剛果紅0.2 g、瓊脂18 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min[14]。

改良淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱粉5.0 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[15]。

改良蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉20.0 g、高粱粉10.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO41.5 g、K2HPO41.5 g、(NH4)2SO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 2.0 g、葡萄糖5.0 g、蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[16]。

改良纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱粉5.0 g、CMC-Na 10 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨 5 g、酵母粉5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱 北京瑞科中儀科技有限公司；BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Neofuge 23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；2100型分光光度計(jì) 大尼科(上海)儀器有限公司；LEICA DM750生物顯微鏡 德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津萊玻特瑞設(shè)備有限公司；Centrifuge 5424R低速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酶芽孢桿菌的初篩

稱取10 g不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪、醋醅樣品置于裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，80 ℃水浴加熱10 min富集芽孢桿菌，對(duì)富集液進(jìn)行10倍梯度稀釋；吸取100 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液分別涂布至淀粉水解培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3個(gè)平行；37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。淀粉水解培養(yǎng)基中加入一定量的盧氏碘液染色，即可看到水解圈的情況，酪素培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基可直接觀察透明圈的大小。

選取初篩培養(yǎng)基中有明顯水解圈的單個(gè)菌落，編號(hào)。采用分區(qū)劃線法連續(xù)純化3代后，固體斜面4 ℃保存?zhèn)溆?。將已純化的芽孢桿菌分別再次接于淀粉水解培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)，計(jì)算兩者比值(D/d)大小，初步確定產(chǎn)酶活力的高低并挑選出比值較大的菌株。

1.3.2 產(chǎn)酶芽孢桿菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株挑取1環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。按照 2%的接種量分別接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，8000 r/min離心10 min，收集上清液為待測(cè)粗酶液。

淀粉酶活力測(cè)定:采用DNS測(cè)其淀粉酶活力[18]。酶活力單位定義：在40 ℃、pH值為3.7的條件下，1 mL酶液每1 min水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

酸性蛋白酶活力測(cè)定:按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999 對(duì)各菌株發(fā)酵液中蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定[19]。酸性蛋白酶酶活力單位定義為1 mL酶液在40 ℃、pH值為3.0的條件下，每1 min酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

纖維素酶活力測(cè)定:按照文獻(xiàn)[20]中方法對(duì)各菌株發(fā)酵液中纖維素酶活力進(jìn)行測(cè)定。纖維素酶活力單位定義為1 mL酶液在38 ℃ 1 min水解羧甲基纖維素產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.4 高產(chǎn)酶菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：對(duì)菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版中芽孢桿菌屬特征和東秀珠的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行部分生理生化特性鑒定[21,22]。

分子生物學(xué)鑒定：采用16S rDNA鑒定。利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行提取，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，以菌株的DNA基因組為模板。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.2 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取4 μL的PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，得到的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，下載同源性高的序列，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶的芽孢桿菌的篩選

從醋廠采集的不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅9份樣品中，分離純化得到60株產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，50株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，48株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌。所篩選菌株產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶菌株的部分透明圈平板情況見(jiàn)圖1。

圖1 所篩選菌株產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶菌株的部分透明圈平板Fig.1 Part of transparent circle plates of strains for producing amylase, acid protease and cellulase

通過(guò)計(jì)算透明圈和菌落生長(zhǎng)直徑的比值，挑選出6株D/d比值大于8的產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，6株D/d比值大于5的產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，6株D/d比值大于5的產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶菌株的初步篩選Table 1 Preliminary screening of enzyme-producing strains

由表1可知，菌株JT10-9，CD92-3，JX4-13的水解圈直徑和菌落直徑比值較大，說(shuō)明其產(chǎn)酶的能力相對(duì)較高。

2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

測(cè)定初篩得到的18株芽孢桿菌的發(fā)酵液中淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶酶活力，并對(duì)每株菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行綜合評(píng)分(淀粉酶酶活力占50%，蛋白酶酶活力和纖維素酶酶活力各占25%)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 初篩菌株淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶酶活力Table 2 The activities of amylase, protease and cellulase of preliminary screened strains

由表2可知，綜合淀粉酶活力、酸性蛋白酶活力和纖維素酶活力，菌株JX4-13的綜合評(píng)分最高，因此篩選菌株JX4-13作為目的菌株并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2.3 菌株個(gè)體及菌落形態(tài)觀察結(jié)果

綜合菌株的初篩和復(fù)篩結(jié)果，選取綜合評(píng)分最高的菌株JX4-13作為目標(biāo)菌株。對(duì)菌株JX4-13進(jìn)行了個(gè)體形態(tài)和菌落形態(tài)的觀察，見(jiàn)圖2。

圖2 菌株 JX4-13 的菌落特征及細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Colony characteristics and cell morphology of strain JX4-13

由圖2可知，菌株JX4-13的菌體形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢端生，孢囊不膨大。菌落呈乳白色，菌落直徑為2.10～2.90 mm，圓形或近圓形，表面干燥，不透明。

2.4 生理生化特征鑒定結(jié)果

表3 菌株JX4-13生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain JX4-13

注：表中“+”表示該項(xiàng)目指標(biāo)為陽(yáng)性或生長(zhǎng)；“-”表示該項(xiàng)目指標(biāo)為陰性或不生長(zhǎng)。

由表3可知，菌株JX4-13的生理生化特征與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中芽孢桿菌屬特征相符，進(jìn)一步確定菌株JX4-13屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.5 16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株JX4-13 16S rDNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株JX4-13 16S rDNA電泳結(jié)果Fig.3 PCR results of JX4-13 16S rDNA gene

以細(xì)菌基因組為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，由圖3可知，菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出大約在1400 bp處存在一條特異性條帶。測(cè)序獲得PCR產(chǎn)物為1395 bp長(zhǎng)度的序列。將序列輸入到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast比對(duì)進(jìn)行同源性比較，并從GenBank選取芽孢桿菌屬的不同菌株，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見(jiàn)圖4。

圖4 菌株JX4-13的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of JX4-13

由圖4可知，菌株JX4-13在系統(tǒng)發(fā)育上與Bacillussubtilis同屬于一個(gè)分支，置信度為99%。通過(guò)Blast比對(duì)，與Bacillussubtilis16S rDNA的同源性高達(dá)99%以上。因此，結(jié)合菌株JX4-13的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株JX4-13為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)山西老陳醋發(fā)酵階段產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶和纖維素酶的菌株進(jìn)行了分離篩選；通過(guò)涂布淀粉、酪素和羧甲基纖維素鈉初篩平板及酶活力測(cè)定，獲得1株能夠產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶和纖維素酶且酶活力較高的菌株JX4-13。對(duì)菌株JX4-13的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果以及 16S rDNA鑒定結(jié)果，最后得出菌株JX4-13為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

菌株JX4-13分離自老陳醋發(fā)酵過(guò)程中，可適應(yīng)山西老陳醋發(fā)酵環(huán)境，比加入酶制劑，從酒醪、醋醅中分離出的土著菌株更容易融入整個(gè)發(fā)酵過(guò)程。后續(xù)可繼續(xù)研究利用該菌株強(qiáng)化大曲或者混菌發(fā)酵應(yīng)用到發(fā)酵過(guò)程中，這將為提高對(duì)原輔料中淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的分解利用，改善老陳醋風(fēng)味，提升老陳醋產(chǎn)品品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

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