魏泉增，胡旭陽

(1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000)

小茴香，既是調(diào)味料，又是具有較高價(jià)值的中藥[1]。小茴香主要香氣成分具有抗癌和抗菌活性[2,3]，因此小茴香的香氣成分報(bào)道較多。香氣成分常見提取方法有3種：水蒸氣蒸餾(WD)法，具有設(shè)備比較簡單、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，得到的主要香氣成分為檸檬烯、反式茴香腦、α-水芹烯及愛草腦等[4-6]。同時(shí)蒸餾萃取(SD)法，具有微量成分提取效率高，適用于熱穩(wěn)定、沸點(diǎn)高的物質(zhì)，得到主要香氣成分為反式-茴香腦、愛草腦、葑酮及茴香醛[7]。固相微萃取(SPME)法，具有無萃取溶劑、操作時(shí)間相對較短、使用的樣品量小的優(yōu)點(diǎn)，得到主要香氣成分是反式-茴香腦、順式-茴香腦、愛草腦、葑酮和p-茴香醛等[8]。目前，一個(gè)產(chǎn)地小茴香氣成分報(bào)道較多，不同產(chǎn)地小茴香香氣成分差異鮮有報(bào)道，本文采用不同提取方法結(jié)合GC-MS，比較了不同產(chǎn)地小茴香香氣成分的差異。采用主成分分析和聚類分析SPME法得到不同產(chǎn)地香氣組成的相似度，這為不同品種的小茴香資源的綜合利用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：5種小茴香的原料均購買于當(dāng)?shù)爻校謩e為四川某某小茴香(以下簡稱為四川小茴香)、甘肅某某小茴香(以下簡稱為甘肅小茴香)、青海某某小茴香(以下簡稱青海小茴香)、山東某某小茴香(簡稱為山東小茴香)，北京某某小茴香(以下簡稱為北京小茴香)。以甘肅、北京、四川、青海、山東的小茴香為原料(打碎30 s，過篩40目)。

1.2 試劑與儀器

試劑：二氯甲烷(色譜純)、蒸餾水。

儀器：7890B-7000C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；萃取手柄和萃取頭65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯) 青島貞正分析儀器有限公司；恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器有限公司；粉碎機(jī) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；電子天平、電爐 上海菁海儀器有限公司；水蒸氣蒸餾裝置 鄭州興華玻璃儀器公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置 賽克斯玻璃儀器有限公司。

1.3 香氣萃取

1.3.1 水蒸氣蒸餾

粉碎的小茴香準(zhǔn)確稱取10.00 g，置于200 mL平底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，沸騰2 h。抽取2 mL揮發(fā)油備用，不同產(chǎn)地分別重復(fù)3次。

1.3.2 同時(shí)蒸餾萃取

粉碎的小茴香準(zhǔn)確稱取10.00 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL去離子水。將40 mL二氯甲烷倒入100 mL圓底燒瓶中。500 mL圓底燒瓶用電爐加熱，100 mL圓底燒瓶用恒溫水浴加熱，溫度控制在60 ℃。兩側(cè)同時(shí)回流時(shí)開始計(jì)時(shí)，提取2 h，抽取2 mL二氯甲烷備用，不同產(chǎn)地分別重復(fù)3次。

1.3.3 頂空固相微萃取

粉碎的小茴香稱取1.00 g置于15 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水，60 ℃平衡30 min，60 ℃頂空吸附30 min，氣相氣化室250 ℃解吸附3 min，不同產(chǎn)地分別重復(fù)3次。

1.4 GC-MS分析條件

水蒸氣蒸餾方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以4 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至160 ℃，再以3 ℃/min升至190 ℃，保持20 min。每個(gè)產(chǎn)地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

同時(shí)蒸餾萃取方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比2∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以3 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃,保持10 min。每個(gè)產(chǎn)地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

固相微萃取方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以4 ℃/min升至90 ℃，然后以5 ℃/min升至140 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。每個(gè)產(chǎn)地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式MS1，掃描范圍29～700 amu。

1.5 香氣物質(zhì)的定性與半定量

香氣物質(zhì)采用NIST 14 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行定性，取相似度大于70%的化合物；用峰面積表示化合物含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PAST軟件，采用模型correlation對不同產(chǎn)地小茴香進(jìn)行主成分分析，采用配對分組算法(paired group)，相似度采用Rho法進(jìn)行不同產(chǎn)地小茴香聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取小茴香香氣成分

2.1.1 SD提取小茴香香氣成分的分析

SD提取小茴香的揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析，結(jié)果見圖1。共鑒定出38種香氣成分，包括18種烴類物質(zhì)、5種醇類、5種醚類、3種醛類和7種酮類物質(zhì)。

圖1 采用SD法不同產(chǎn)地小茴香香氣成分Fig.1 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SD method

由圖1可知，采用SD法，香氣成分中醚類物質(zhì)的含量最多,但北京、甘肅、青島、山東4個(gè)產(chǎn)地的小茴香香氣中醚類物質(zhì)含量相似，四川小茴香香氣中，醚類含量偏低。5個(gè)產(chǎn)地小茴香香氣中，烴類物質(zhì)含量次多，四川小茴香中烴類物質(zhì)偏低，其他產(chǎn)地?zé)N類物質(zhì)含量相似。5個(gè)產(chǎn)地小茴香醛類中，山東含量最高，四川含量最低，其他3個(gè)產(chǎn)地含量相似。5個(gè)產(chǎn)地中四川酮含量偏低，其他4個(gè)產(chǎn)地酮含量相似。而5個(gè)產(chǎn)地小茴香、醇類、酚類、酯類含量較少。

2.1.2 SPME提取小茴香香氣成分的分析

采用SPME提取小茴香的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，結(jié)果見表1。不同產(chǎn)地的小茴香中共鑒定出19種香氣成分，其中包括3種烴類物質(zhì)、7種萜烯，1種醇類、1種酯類、2種醚類、2種醛類、2種酮類和1種酸類物質(zhì)。采用SPME法，見圖2。5個(gè)產(chǎn)地小茴香香氣成分中醚類物質(zhì)含量最多，不同產(chǎn)地醚類含量相似。烴類物質(zhì)四川含量偏低，其他4個(gè)產(chǎn)地含量相似。醛類物質(zhì)含量，甘肅含量最低，山東含量最高，其他3個(gè)產(chǎn)地含量相似。5個(gè)產(chǎn)地小茴香酮類含量相似。5種產(chǎn)地小茴香、酯類、酸類、醇類含量較少。

圖2 采用SPME法不同產(chǎn)地小茴香香氣成分Fig.2 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SPME method

編號名稱中文名稱北京甘肅青海山東四川1Xanthoxylin花椒素酯類NDND14725260±2653215.41NDND2D-Carvone香芹酮酮類2029152.33±169642.753093422±1036892.852023643.67±107181.331892555.67±162335.2510772785±130782.733Fenchone葑酮酮類13173987±1009928.6714691848±2226025.8621731403.67±972525.420928459±4084967.3913555742.67±1756585.84α-Phellandreneα-水芹烯萜烯NDND1720673.67±181396.53NDND5γ-Terpineneγ-松油烯萜烯16643573±1058333.4516380118±6457782.3319586802±4220661.8428389758±993455.7611464940±837551.886Benzene,1-methyl-3-(1-methylethyl)-1-甲基-(2-甲基乙基)-苯烴類12623540.33±547940.17526635.67±2052908.8513289688.67±2739676.2520397755±1567311.2820111593.33±1610113.867Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-雙環(huán)[3.1.0]己烷,4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-烴類ND3282601±119064.64ND4353095.33±216311.34ND

續(xù) 表

注：ND表示未檢出。

2.1.3 WD提取小茴香香氣成分分析

采用WD法提取小茴香的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，數(shù)據(jù)未給出。結(jié)果表明：5種產(chǎn)地小茴香香氣成分中共鑒定出107種香氣成分，其中包括35種烴類物質(zhì)、23種醇類、14種醚類、1種酸類、1種酚類、10種酯類、10種酮類和13種其他物質(zhì)。采用WD法，見圖3。5個(gè)產(chǎn)地小茴香香氣成分中醚類物質(zhì)含量最多，四川小茴香醚類含量最多，北京小茴香醚類含量最少，其他3個(gè)產(chǎn)地小茴香醚類含量差異較大。烴類物質(zhì)甘肅含量最多，北京含量最少，其他3個(gè)產(chǎn)地小茴香烴類含量差異較大。酮類、醛類、酸類、酯類、醇類和酚類含量較少。

圖3 采用WD法不同產(chǎn)地小茴香香氣成分Fig.3 Aroma compounds of fennel from different places of origin with WD method

SD法、SPME法、WD法3種提取方法分析不同產(chǎn)地的小茴香香氣成分，結(jié)果表明醚類物質(zhì)種類少，但醚類的含量大。醇類、酯類、酮類和醛類含量少，烴類物質(zhì)種類最多，烴類物質(zhì)的含量也少，酸類和酚類含量最少。SD法、SPME法和WD法提取不同產(chǎn)地小茴香香氣種類含量大體相似，醚類含量最多，但不同提取方法對提取不同產(chǎn)地小茴香不同香氣種類含量有較明顯差異。

2.2 不同產(chǎn)地小茴香香氣成分比較

2.2.1 醇類香氣物質(zhì)比較

5種小茴香中共檢測到26 種醇類物質(zhì)，北京、甘肅、青海、山東、四川分別檢出2，11，3，20，15種，SD法檢測到5種醇類,SPME法檢測到1種醇類,WD法檢測到24種醇類。結(jié)果表明：采用WD法,醇類在5 種小茴香種差異明顯。桉葉油醇是小茴香中含量最高的醇。松油醇具有油味、樟腦氣味和甜味。甘肅、青海、四川產(chǎn)地的小茴香WD法檢測到松油醇，其他產(chǎn)地未檢測到。

2.2.2 酯類香氣物質(zhì)比較

5個(gè)產(chǎn)地小茴香中共檢測到10種酯類物質(zhì)，其中，WD法檢測出10種酯類物質(zhì)，SPME法檢出1種，SD法未檢出酯類。WD法檢出5個(gè)產(chǎn)地小茴香酯類物質(zhì)種類差異明顯，四川檢出8種，9,12-十八碳二烯酸甲酯是含量最高的酯類。甘肅小茴香檢出丁酸-3-甲基-異戊酯和乙酸松油酯。采用SPME法在青海小茴香只檢出1種酯類，花椒素。

2.2.3 醛類香氣物質(zhì)比較

5個(gè)產(chǎn)地小茴香共檢測出4種醛類物質(zhì),其中,SD法檢測出2種,SPME法檢測出2種,WD法檢測出4種。結(jié)果表明：具有類似山楂味的3-甲氧基苯甲醛采用這3種方法在5個(gè)產(chǎn)地的小茴香中都檢測到。采用WD法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在甘肅和青海小茴香中含量>在北京小茴香中含量。采用SD法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在北京小茴香中含量>在青海和四川小茴香中含量>在甘肅小茴香中含量。采用SPME法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在青海和北京小茴香中含量>在甘肅小茴香中含量。由此，采用不同提取不同產(chǎn)地的小茴香同一香氣成分含量的變化并不相同，這表明不同香氣提取方法對不同產(chǎn)地小茴香香氣成分的收率也不同。2-乙縮醛-6-甲基-3,5-庚二烯醛和2-甲基-3-苯基-丙醛只在四川小茴香中檢測到。

2.2.4 酮類香氣物質(zhì)比較

5種小茴香中共檢出13種酮類物質(zhì)，其中SD法檢出6種,SPME法檢出2種,WD法檢出10種。葑酮(fenchone)是抗菌素的一種，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素。呈濃郁甜的果香、青香和木香，具有鮮花和水果甜香氣。采用WD法提取葑酮，山東小茴香中含量>甘肅小茴香中含量>四川和青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。香芹酮有清涼而特有的芳香甜味，WD法提取香芹酮，四川小茴香中含量>甘肅、山東、青海小茴香中含量，北京小茴香中沒有檢測到，但采用SPME法和SD法在北京小茴香中檢測到了香芹酮。采用SD法檢出了1-(3-甲氧基苯基)-1-丙酮、薄荷酮、莰酮，其他2種方法未檢出。

2.2.5 萜烯類香氣物質(zhì)比較

5種小茴香中共檢出25種萜烯類香氣物質(zhì)，其中SD法檢出12種物質(zhì)，SPME法檢出8種物質(zhì)，WD法檢出23種物質(zhì)。檸檬烯是一種天然的功能單萜，有類似檸檬的香味。檸檬烯具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌作用。采用WD法，甘肅小茴香中檸檬烯含量>山東小茴香中含量>四川小茴香中含量>北京小茴香中的含量>甘肅小茴香中含量。采用這3種方法均檢測到了α-水芹烯、β-月桂烯、β-水芹烯、γ-松油烯、3-蒈烯、檸檬烯這6種萜烯。氧化檸檬烯只有WD法檢測到，其他2種方法未檢測到。SPME法檢測到了α-蒎烯。α-蒎烯具有植物和松節(jié)油香氣[9]，感官閾值很低，香氣明顯。

2.2.6 醚類香氣物質(zhì)比較

5種小茴香中檢出11種醚類。其中SD法檢測出5種，SPME法檢出2種，WD法檢出10種。茴香腦是小茴香中主要的香氣成分，可用于治療癌癥及長期接觸放射線或藥物所致或原因不明的低白細(xì)胞癥[10]。草蒿腦呈大茴香似香氣。采用SD法，山東小茴香中茴香腦含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量>甘肅和四川小茴香中含量，采用SPME法，山東、北京、青海、四川小茴香中茴香腦含量相似，甘肅小茴香中茴香腦含量明顯偏低。采用WD法，山東小茴香中茴香腦含量>四川小茴香中含量>甘肅小茴香中含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。采用SD法、SPME法和WD法提取不同產(chǎn)地的小茴香中香氣成分，其中草蒿腦在不同產(chǎn)地小茴香中香氣也出現(xiàn)了與茴香腦相似的情況，不同的前處理方法，導(dǎo)致草蒿腦在不同產(chǎn)地小茴香香氣中含量發(fā)生了變化。采用WD法，檢測到了對-丙烯基-1-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯、細(xì)辛腦、肉豆蔻醚、丁香酚甲醚、4-乙酰-1-甲基環(huán)己烷、(R)-氧化檸檬烯，而采用SD法和WD法在這5種小茴香中沒有檢測到。

2.2.7 烴類物質(zhì)

除以上相對含量較高的香氣物質(zhì)外，還有少量的烷烴類物質(zhì)，共檢出15種物質(zhì)。其中SD法檢出7種物質(zhì)，SPME法檢出3種物質(zhì)，WD法檢出12種烷烴，這類物質(zhì)大部分不參與呈香。

2.3 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種降維或者把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[11-13]。將5個(gè)產(chǎn)地小茴香樣品的二維數(shù)據(jù)導(dǎo)入到PAST軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，5個(gè)不同產(chǎn)地小茴香采用SPME提取方法重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。不同產(chǎn)地小茴香香氣成分PCA的分值圖見圖4，第一主成分的貢獻(xiàn)率為41.9%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為23.7%。

圖4 PCA分值圖Fig.4 Score plot for PCA

由圖4可知，青海、山東、甘肅、北京、四川5個(gè)產(chǎn)地具有明顯差異，這為區(qū)分不同產(chǎn)地的小茴香提供了潛在的線索。

圖5 載荷圖(圖中的數(shù)字對應(yīng)表1中)Fig.5 Loading plot(the figure in the plot corresponds to that of table 1)

由圖5可知，被分析化合物對主成分的影響，如果化合物遠(yuǎn)離原點(diǎn)表明這個(gè)化合物對主成分有強(qiáng)烈的影響，那么這些化合物可能就是區(qū)分不同產(chǎn)地小茴香的關(guān)鍵化合物，以γ-松油烯(5號，表1中)和檸檬烯(11號，表1中)為潛在特征物，為區(qū)分不同產(chǎn)地小茴香提供可能。

2.4 聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性的相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)多個(gè)品種聚合，從而完成聚類分析的過程[14]。對不同產(chǎn)地小茴香進(jìn)行兩兩比對，相似性系數(shù)為0.8～1。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地小茴香香氣成分明顯不同。

圖6 不同產(chǎn)地小茴香的聚類分析圖Fig.6 Clustering analysis diagram for the fennel from different places of origin

由圖6可知，四川小茴香與其他四個(gè)產(chǎn)地小茴香香氣成分的相似性最差，山東和北京的小茴香香氣成分最相似，由聚類分析結(jié)果表明，產(chǎn)地相近的小茴香香氣成分相似性大，而產(chǎn)地遠(yuǎn)的小茴香香氣成分相似性小。

3 結(jié)論

WD法、SD法、SPME法3種提取方法對5個(gè)不同產(chǎn)地的小茴香香氣成分提取，而后進(jìn)行GC-MS分析，共鑒定出104種化學(xué)組分，包括15種烴類、24種醇類、10種酯類、4種醛類、1種酚類、2種酸類、11種醚類、13種酮類、萜烯24種。其中鑒定WD法93種、SD法39種、SPME法19種。3種提取方法都表明5個(gè)產(chǎn)地小茴香主要成分是茴香腦和草蒿腦。WD法測得的香氣物質(zhì)種類最多，SPME法測得的香氣物質(zhì)種類最少。不同的提取方法提取不同產(chǎn)地小茴香香氣成分含量影響較大。SPME-GC-MS結(jié)合PCA分析結(jié)果表明：γ-松油烯和檸檬烯可為潛在特征物標(biāo)記物，區(qū)分不同產(chǎn)地小茴香。聚類分析結(jié)果表明：產(chǎn)地相近的小茴香香氣成分也相似。

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