高巖 劉影 徐淑蘭 周磊

南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（廣東省口腔醫(yī)院）1種植中心，2牙體牙髓科（廣州510280）

納米技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)在生物材料研究方面比較熱門的一個領(lǐng)域。很多納米的表面證實具有較好的理化特性及生物活性，如納米管，納米線等［1?3］。研究細胞與納米材料的直接接觸反應(yīng)可以讓我們更深入的探索細胞反應(yīng)的早期過程［4?6］。近年來，大量的體外實驗已經(jīng)證實納米線可以作為較好的靶向運輸體，還可以傳遞生物信息［7?9］。納米線在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用需要前期大量基礎(chǔ)的研究。納米線的生物相容性和細胞的反應(yīng)仍然存在爭議，其形貌、化學(xué)組成、表面結(jié)構(gòu)或表面功能基團等均會對細胞的早期反應(yīng)起重要作用［10-11］。理解細胞與鈦生物材料之間的相互作用，有利于促進生物材料的迅速發(fā)展。目前大量基礎(chǔ)研究重點是為了增強細胞與材料之間的整合，這有利于臨床口腔種植體的長期成功。

二氧化鈦作為優(yōu)良的半導(dǎo)體廣泛應(yīng)用于光化學(xué)領(lǐng)域。二氧化鈦包含3種不同晶型，銳鈦礦、金紅石和非晶態(tài)鈦。實驗證實［12?16］，銳鈦礦和金紅石具有優(yōu)良的生物活性，可以促進細胞早期的黏附增殖等反應(yīng)。本研究擬在純鈦表面制備出獨特的金紅石/銳鈦礦納米線，并通過實驗證實其體外生物活性。

1 材料與方法

1.1 銳鈦礦/金紅石納米線（AR@NWs）的制備利用數(shù)控機床將四級純鈦板切割成鈦片（直徑15 mm，厚度1.5 mm），再利用250、400、600、1 000目SiC砂紙逐級打磨拋光鈦片，繼將鈦片用無水丙酮、無水乙醇、去離子水依次超聲清洗2次，15 min/次，待用。（1）將備用的鈦片呈一定角度傾斜立于25 mL容積的聚四氟乙烯內(nèi)襯里，繼將10 mL 1 mol/L NaOH溶液倒入容積25 mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯里，使NaOH溶液浸沒鈦片，然后置于高壓反應(yīng)釜內(nèi)密封，再置于220℃烘箱中加熱8 h。散熱后取出鈦片，去離子水清洗鈦片表面，置于50℃烘箱充分干燥；（2）進一步將處理過的鈦片置于0.02 mol/L的稀鹽酸溶液中1 h，再用去離子水清洗表面，徹底去除Na+；（3）最后置于馬弗爐中，600℃煅燒1 h，散熱后取出最終得到AR@NWs。通過堿熱處理在鈦片上制備出AR@NWs，期間生成STi＠NWs，HTi＠NWs和AR@NWs三種不同晶型的納米線。因此，本實驗分光滑鈦片組（PT）、STi＠NWs、HTi＠NWs和AR@NWs四組。

1.2 銳鈦礦/金紅石納米線表面特征檢測 采用場發(fā)射掃描電鏡（FESEM，JSM?6330F，JEOL，Japan）在高真空環(huán)境下，設(shè)置加速電壓20.0 kV，分別在500×和10 000×掃描電鏡下觀察各組鈦片表面納米線形貌。刮取鈦片表面納米線并分散于無水乙醇中，然后采用透射電鏡（TEM，JEM?2010，JE?OL，Japan）在真空環(huán)境下，200 kV加速電壓，觀察納米線表面形貌。X射線衍射儀（XRD，D8 AD?VANCE，Bruker，Germany）檢測表面晶型組成。

1.3 細胞免疫熒光染色行細胞計數(shù)及細胞形態(tài)觀察 復(fù)蘇凍存的MG63細胞株，接種至含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后置于細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2濃度）中培養(yǎng)，24 h后換液，去除未黏附的細胞，再加入培養(yǎng)基，每48 h換液，當(dāng)細胞密度達到約80%時，PBS清洗后再用0.25%胰酶消化，然后加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，進而進行傳代。傳代3～5次，當(dāng)細胞生長狀態(tài)良好時，0.25%胰酶消化后加入培養(yǎng)基制備細胞懸液，待用。

將各組鈦片置于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，利用細胞計數(shù)板進行計數(shù)統(tǒng)計，按照1×104/cm2細胞密度將細胞接種至細胞培養(yǎng)板內(nèi)各組鈦片表面，在培養(yǎng)1、2、4 h時，吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)基，并將鈦片移至新的培養(yǎng)板內(nèi)。先用PBS清洗，去除尚未充分黏附的細胞；再用細胞固定液3.7%多聚甲醛行細胞固定20 min；然后用0.1%Triton X?100行細胞通透5 min，再用PBS清洗去除多余Triton；然后用1%BSA封閉30 min；最后用Hoechst 33342（10 μg/mL）行細胞核染色10 min，PBS清洗后再用1∶40稀釋的Alexa Flu?or? 635 phalloidin對細胞骨架肌動蛋白F?actin進行染色30 min，最后置于熒光顯微鏡下觀察。

將各組鈦片置于熒光顯微鏡下，在100×放大倍數(shù)下拍攝照片。每組設(shè)置3個樣本，每個鈦片樣本顯微鏡下隨機選擇4個視野進行攝片，再用Image?Pro Plus 6.0圖像分析軟件計數(shù)，按照下面公式計算細胞黏附率，行統(tǒng)計學(xué)分析。

黏附率（%）=細胞黏附量/接種細胞量 ×100%

進一步在400×放大倍率下觀察培養(yǎng)4 h的細胞形態(tài)。顯微鏡下分別對Hoechst 33342細胞核染色和Alexa Fluor? 635 phalloidin細胞肌動蛋白F?ac?tin染色的各組鈦片表面進行攝片，再用Image?Pro Plus 6.0軟件進行圖像的合成，分析細胞生長情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值結(jié)果以±s表示。細胞黏附實驗采用析因設(shè)計分析，進一步采用單因素方差進行組間分析，Levene′s test檢驗方差齊性，方差齊則采用Bonferroni檢驗對組間結(jié)果進行兩兩比較，方差不齊則采用Welch方法進行方差分析，Dunnett′s T3檢驗對組間結(jié)果進行兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈦片表面形貌觀察 圖1為電鏡下鈦片表面形貌。圖1A和1B為光滑鈦片PT掃描電鏡下表面形貌，可見明顯呈方向一致的細小劃痕。本實驗通過堿熱法經(jīng)三步成功制備出成簇狀的棒狀納米線（圖1C、1D），各階段生產(chǎn)的納米線表面形貌均無明顯差異。透射電鏡25 000×下可見納米線直徑約200 nm（圖1F）。

2.2 鈦片表面晶相檢測 圖2為四組鈦片表面晶相衍射圖，即在堿熱合成AR＠NWs過程中的不同階段生成的不同納米線的表面晶型檢測結(jié)果。如圖2a僅有唯一圖2b可以檢測到由TiO6正八面體組成的二維正交晶系的鈦酸鈉 Na2Ti2O5·H2O晶型，圖2c可以檢測到由TiO6正八面體組成的二維正交晶系的 H2Ti2O5·H2O 晶型［17?19］。圖 2d 即為 AR＠NWs納米線的晶相，可見有銳鈦礦和金紅石的峰出現(xiàn)。

圖1 掃描電鏡和透射電鏡下光滑鈦片和納米線表面形貌Fig.1 The surface typical topography of PT and NWs using SEM and TEM

2.3 細胞免疫熒光染色下細胞粘附率計算及細胞形態(tài)觀察 圖3為四組鈦片表面細胞培養(yǎng)1、2和4 h細胞黏附率比較?？傮w上看，四組納米線鈦片表面細胞黏附數(shù)量隨孵育時間延長呈遞增趨勢，每個時間點組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PT和AR＠NWs表面細胞黏附率各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但明顯高于STi＠NWs和HTi＠NWs組（P＜ 0.05）。圖4示四組鈦片表面細胞培養(yǎng)4 h后免疫熒光染色下細胞形態(tài)結(jié)合圖3，可發(fā)現(xiàn)100倍放大倍率下各組鈦片表面均有大量細胞生長，較STi＠NWs組（圖4B）和HTi＠NWs（圖4C）組，PT組（圖4A）和AR＠NWs（圖4D）表面細胞數(shù)量相對較多（P＜0.05）。鈦片表面細胞孵育4 h后，各組細胞開始伸展，部分細胞伸出偽足。400倍下可見PT組（圖4E）表面細胞伸展方向與鈦片表面細小斜痕相一致，AR＠NWs組（圖4H）可見細胞間偽足相互接觸，建立聯(lián)系，而STi＠NWs組（圖4F）和HTi＠NWs組（圖4G）表面細胞生長狀態(tài)較差，只有個別細胞伸出偽足。

圖2 各組純鈦表面晶相檢測Fig.2 The crystal of different titanium surface

3 討論

在過去的幾十年，大量的納米結(jié)構(gòu)表面被制備出。一圍的納米線被認為是極好的靶向或生物分子輸送載體［7?9］和可持續(xù)能源［20］。本實驗通過堿熱處理在鈦片表面制備出獨特的直徑約200 nm簇狀銳鈦礦/金紅石納米線。

制備二氧化鈦納米線有很多方法，其中自組裝法是目前制備納米材料研究的熱點方法，主要包括氣象沉積法和水熱處理法。此方法是利用分子、離子之間的某些作用力較強的化學(xué)鍵或物質(zhì)特有的晶體結(jié)構(gòu)的相互作用，使材料在一維方向上生長。水熱處理法因容易操作，方法簡單，成為目前制備二氧化鈦納米線最常用的科研研究方法。據(jù)報道將二氧化鈦納米粒與雙氧水和鹽酸的混合液在高溫下處理3～12 h，可以得到長度10～80 μm的金紅石二氧化鈦納米線［21］。

大量研究證實［12?16］，表面晶型結(jié)構(gòu)作為重要的表面化學(xué)特性，利于材料表面成骨，而銳鈦礦和金紅石同時存在的表面較單一的晶型結(jié)構(gòu)可以更加明顯地促進早期骨整合地建立。因此本實驗中制備的銳鈦礦/金紅石納米線理論上利于早期的成骨細胞反應(yīng)。

圖3 各組鈦片表面細胞培養(yǎng)1、2、4 h后細胞黏附率Fig.3 The rate of osteoblasts attached to the titanium surfaces after 1,2 h and 4 h of incubation

圖4 各組鈦片表面細胞培養(yǎng)4 h后免疫熒光染色下細胞形態(tài)Fig.4 The cell morphology of different groups of titanium surfaces after 4 h incubation using immunofluorescent staining

理解細胞和生物材料間的相互作用有利于促進生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。研究表明［22］，純鈦生物材料植入人體后，首先與周圍的血液及體液相接觸，促進蛋白在材料表面吸附，進而促使成骨細胞向材料表面遷移和黏附，隨之引導(dǎo)細胞在材料表面的伸展和成長，最終表現(xiàn)為增殖分化成骨。本實驗中在4 h內(nèi)隨著細胞孵育時間的延長，各組表面細胞黏附率增加。相對于光滑鈦片組，只有AR＠NWs組表面細胞黏附率無明顯差異，STi＠NWs和HTi＠NWs組一定程度上抑制了細胞的黏附，然而三組納米線組表面細胞黏附率水平又存在顯著性差異。目前，納米線的細胞相容性及生物活性研究相對復(fù)雜，存在一定的爭議。本實驗中，3種表面形貌相同但化學(xué)成分不同的納米線陣列，一定程度上可以抑制細胞的黏附，原因可能與納米線結(jié)構(gòu)可以破壞細胞黏著斑的組裝有關(guān)。而且，表面的納米結(jié)構(gòu)使納米線產(chǎn)生細胞排斥性［23］。另有研究報道［24］，納米線結(jié)構(gòu)可以穿入細胞內(nèi)部從而影響細胞活力，最終導(dǎo)致細胞凋亡。AR＠NWs組相對于STi＠NWs和HTi＠NWs組表面細胞并沒有明顯抑制細胞的黏附，可能歸因于表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，即表面化學(xué)成分和表面晶型結(jié)構(gòu)在一定程度上補償了納米線的細胞排斥性。細胞胞體骨架在材料表面的伸展、延伸和生長是細胞行使后續(xù)生物學(xué)性能和細胞間信號傳導(dǎo)至關(guān)重要的起始步驟［25］。在本實驗中，相對于 STi＠NWs和 HTi＠NWs組，PT組和AR＠NWs組表面細胞呈長條形或多邊形的體積增大，并有較粗長的偽足伸出，細胞間突觸接觸建立聯(lián)系。細胞間突觸相互接觸可以進一步促進細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，利于細胞的進一步生長［22］。

目前，生物材料和細胞間的相互作用仍是一個具有爭議而且復(fù)雜的問題。材料表面碳氫化合物等污染物、親水性、表面電荷和表面Ti?OH的存在等均可能起到影響外，材料表面的物理化學(xué)特性包括表面晶型、表面粗糙度、表面能等等可能也會起到一定的作用。本實驗中制備的簇狀銳鈦礦/金紅石納米線因表面化學(xué)成分和晶型結(jié)構(gòu)的不同，在一定程度上補償了納米線的細胞排斥性，為材料表面納米結(jié)構(gòu)的研究提供理論基礎(chǔ)。

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