支媛婷 ，許鵬 ，黨永巖 ，葉希韻 ，顧軍

（1.上海長海醫(yī)院，上海 200433；2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)院，上海 200241）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病。G蛋白耦聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）超家族是目前最大的與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細胞表面分子家族[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)大量的趨化因子和趨化因子受體在銀屑病皮損區(qū)的表達較無皮損區(qū)皮膚明顯增多，但是GPCRs是否在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用還不清楚[2]。銀屑病是由T細胞介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病，可以導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞的過度增殖[3]。起初銀屑病被認為是Th1細胞介導(dǎo)的免疫性疾病。后來，人們發(fā)現(xiàn)Th17細胞及其下游因子也對銀屑病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[4-5]。其可以產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-17、IL-12、IL-22和IL-23等細胞因子從而激活角質(zhì)形成細胞，導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞的過度增殖[6]。雖然已有大量針對銀屑病的發(fā)病機制的研究，但銀屑病的具體病因目前尚不明確。

GPCRs超家族內(nèi)包含了超過了人類基因組1%的基因[1]。GPCRs在炎癥反應(yīng)中起到十分重要的作用，炎癥性細胞通過表達并激活大量GPCRs（如化學(xué)誘導(dǎo)劑、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子），促使炎癥因子的合成和分泌[1]。例如，GPCRs激活可以激活NF-κB，從而促進炎癥因子的表達[7]。鑒于銀屑病是一種常見的皮膚慢性炎癥性疾病，而GPCRs在調(diào)控炎癥中起到一定的作用，推斷GPCRs在銀屑病的發(fā)病機制可能具有一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)GPCRs家族中的CCR6，在IL-23誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型的皮損中的表達量明顯增加[8]。然而，GPCRs在銀屑病中的具體能夠還不明確。

人們最早是通過抑制表皮角質(zhì)形成細胞的增生治療銀屑病[9]。近來有研究發(fā)現(xiàn)減少T細胞的增殖和擴散也能控制銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[10]。目前臨床上有很多用于治療銀屑病的藥物和方法，但是沒有一種方案可以根治銀屑病。近年來，隨著人們對GPCRs的深入研究，發(fā)現(xiàn)包括多種趨化因子在內(nèi)的GPCRs是一種良好的潛在藥物靶點[11-12]。因此，本研究希望通過研究GPCRs在銀屑病發(fā)病機制中的作用，探討運用抑制G蛋白耦聯(lián)受體的方法治療銀屑病的可能性，為后期尋找銀屑病的新的治療靶點提供依據(jù)。

本研究利用基因芯片檢測技術(shù)和實時定量PCR的方法檢測了銀屑病患者受累皮膚組織與未受累皮膚組織中，具有差異性表達的GPCRs（變化倍數(shù)>2倍，P<0.05）。利用實時熒光定量PCR（RTPCR）用于驗證基因芯片的檢測結(jié)果。筆者的實驗結(jié)果挑選出了可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)的GPCRs，為銀屑病的研究提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗選取上海長海醫(yī)院皮膚科3例尋常型銀屑?。ò邏K型銀屑病）患者，要求2年內(nèi)無特殊治療史，記錄患者年齡、性別、病史，簽署局麻下皮膚活檢術(shù)知情同意書及有創(chuàng)操作知情同意書。選取雙下肢同個部位（雙下肢遠端屈側(cè)）對稱分布的銀屑病皮損和未受累皮膚，分別行局麻下皮膚活組織檢查術(shù)。將切取的皮膚組織分別放入6個冷凍保存管，實驗組（即皮損組）標(biāo)記為Ⅰa/Ⅱa/Ⅲa，對照組標(biāo)記為Ⅰb/Ⅱb/Ⅲb，立即投入液氮冷凍，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 HE染色 用4%多聚甲醛固定病人皮膚組織并將其包埋在石蠟中。組織切片呈約5 μm厚，置于載玻片上，進行蘇木精-伊紅染色。

1.3 RNA提取 從病人取下皮膚組織，迅速放入液氮中，使用TRIZOL試劑盒（Takara）分離RNA。分別使用QIAGEN RNeasy Mini Kit和RNA 6000 NanoLabChip Kit（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany）測定RNA純度和RNA完整性。質(zhì)量檢測：要求樣品最小RIN≥7.0。

1.4 基因芯片雜交，洗滌和掃描 應(yīng)用Agilent表達譜芯片（Agilent Sure Print G3 Human Gene Expression Microarray V3.0）進行基因芯片檢測[13]。

1.5 差異基因的分析 應(yīng)用GeneSpring GX軟件版本12.0（Agilent Technologies）對基因表達進行標(biāo)準(zhǔn)化。GO和KEGG通路分析用于獲得所有差異表達的基因。與參考RNA的表達水平相比，如果P<0.05，則確定基因差異表達，且變化倍數(shù)（FC）為>2或<1/2。

1.6 熒光實時定量PCR 總RNA體積為20 μL逆轉(zhuǎn)錄 2 μg，包括 5×RT SuperMix（Vazyme），無 RNA酶的ddH2O和模板RNA。將RT產(chǎn)物的等分試樣用于定量RT-PCR分析。每個反應(yīng)物由12.5 μL SYBR-綠（Takara），1 μL 100 nM 有義和反義引物，2μLcDNA和9.5μLH2O組成，總體積為25μL。PCR使用以下參數(shù)：95℃5 min，隨后40個循環(huán)，95℃30 s，55℃30 s，72 ℃ 30 s。基因表達對GAPDH mRNA進行標(biāo)準(zhǔn)化。所用的引物序列見表1。

1.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。t檢驗用于評估組之間的統(tǒng)計學(xué)差異；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3例銀屑病皮損的組織學(xué)表現(xiàn) 本實驗選取的3例斑塊型銀屑病患者皮損的臨床表現(xiàn)均較典型，可見雙下肢大小不等的紅色斑塊，境界清晰，形狀不規(guī)則，皮疹表面覆蓋較厚白色鱗屑，見圖1。HE染色結(jié)果顯示表皮角化過度、角化不全，表皮顆粒層較正常組織減少，表皮大致呈杵狀增生，真皮乳頭上延，真皮乳頭內(nèi)可見毛細血管擴張充血，真皮乳頭上方的表皮變薄，真皮淺層血管周圍可見以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，見圖2。3例實驗組皮損的病理表現(xiàn)符合斑塊型銀屑病的病理特點。

圖1 3例銀屑病患者皮損的臨床照片

表1 Qpcr所需要的引物序列

圖2 3例銀屑病患者皮損的病理照片

2.2 GPCRs相關(guān)差異表達基因的篩選 圖3是GPCRs家族基因芯片的熱點圖，利用基因芯片技術(shù)檢測出GPCRs家族在銀屑病皮損和未受累皮膚之間共有32個差異基因，其中有15個上調(diào)基因和17個下調(diào)基因。上調(diào)基因（差異倍數(shù)>2，P<0.05）包括CXCR6，GPR110，OXTR，GPR45，GPR171，CCR7，ACKR2，F(xiàn)ZD5，CXCR4，CXCR2，PTARF，XCR1，LPHN2，GPR132，CCR5；下調(diào)基因（差異倍數(shù)<1/2，P＜0．05） 包括 BAI2，DRD4，ACKR1，F(xiàn)2R，ADRA2A，GPR146，CNR1，LGR6，GPRC5C，ADRA1B，CHRM3，OXGR1，NPY1R，GPR12，CHRM1，ADRB2，GPR182。

圖3 GPCR家族在銀屑病皮損和未受累皮膚之間的差異表達基因

圖4 RT-PCR的結(jié)果與基因芯片的結(jié)果基本一致

2.3 GPCRs相關(guān)差異基因的驗證 通過熒光定量PCRRT-PCR驗證,得出的結(jié)論與基因芯片檢測結(jié)果相似。實驗組銀屑病皮損中的CXCR6、GPR110、GPR171、CXCR2、PTAFR、LPHN2 這 6 個基因的表達要明顯高于對照組正常皮膚。相反，GPR12、CHRM1、ADRB2、CHAM、NPY1R、ADRA1B、GPR182、ADAR2A、LGR6、GPRC5C、F2R 這 11 個基因相比于正常皮膚，在銀屑病皮損中的表達呈下調(diào)趨勢。因此，RT-PCR驗證結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果大致相同。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥的皮膚疾病，發(fā)病機制目前尚未十分明了。雙生子研究、流行病學(xué)調(diào)查及HLA研究均表明銀屑病的產(chǎn)生具有遺傳傾向，對與銀屑病發(fā)病相關(guān)基因表達的研究可為探索銀屑病復(fù)雜病因奠定基礎(chǔ)。

曾有研究報道CXCR6參與了銀屑病的發(fā)病[8]。Claudia等[14]的研究表明CXCL16-CXCR6可介導(dǎo)CD8+T細胞進入皮膚組織，可引起銀屑病的發(fā)生或加重。Kulke等[15]發(fā)現(xiàn)CXCR1和CXCR2誘導(dǎo)的中性粒細胞活化和CXCR2介導(dǎo)的角質(zhì)形成細胞增生共同導(dǎo)致銀屑病皮損的特征性變化。這些研究結(jié)果也證明了GPCRs在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn) 6個 GPCR相關(guān)基因（CXCR6，GPR110，GPR171，CXCR2，PTAFR 和 LPHN2） 在銀屑病皮損中明顯上調(diào)，11個GPCR相關(guān)基因（GPR12，CHRM1，ADRB2，CHAM3，NPY1R，ADRA1B，GPR182，ADAR2A，LGR6，GPRC5C 和 F2R） 在銀屑病皮損中有下調(diào)趨勢。這項研究數(shù)據(jù)表明：這些差異性表達的基因可能在銀屑病的發(fā)病過程中起到非常重要的作用，有可能是促進銀屑病的發(fā)生，也有可能是保護的作用。這需要后續(xù)的一些機制實驗去證明。

本實驗發(fā)現(xiàn)并驗證了人類銀屑病皮損組織中較正常皮膚組織差異表達的基因。大約有32個GPCRs相關(guān)基因可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)。定量RTPCR進一步驗證了這些基因中的17個基因在銀屑病皮損和未受累皮膚組織之間的差異性表達。此結(jié)論將為深入研究GPCRs在人類銀屑病發(fā)病過程中的作用提供有力幫助。

因此，GPCRs相關(guān)基因在銀屑病皮損和未受累皮膚之間的差異表達可能將為揭示GPCRs在銀屑病發(fā)病中的作用提供重要線索。

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