余王琴 孔麗婭 羅玉玲 劉曉谷 鄭小偉

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為支氣管哮喘是由肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、T細(xì)胞等參與的炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為特征[1]。目前哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，相關(guān)研究表明，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的免疫應(yīng)答與哮喘的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以卵清蛋白致敏法結(jié)合多因素復(fù)合法建立腎氣虛哮喘模型，通過大鼠脾臟流式細(xì)胞術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)出Th17細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞亞群的百分比及其變化情況，為探究哮喘的發(fā)病及藥物作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar雄性大鼠48只，體重200～250g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑：大鼠睪酮（T）ELISA試劑盒和大鼠甲狀腺素（T4）ELISA試劑盒（杭州誠(chéng)維生物科技有限公司）；卵清白蛋白（Sigma有限公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（凱基生物有限公司）；氫氧化鋁分析純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品：①益腎喘寧湯：主要由山藥、山萸肉、熟地黃、澤瀉、天漿殼、苦參、茯苓、牡丹皮、沉香片、五味子、黛蛤散、旋覆花、生黃芪等組成。將藥液濃縮至2.4kg/L。②普米克令舒（吸入用布地奈德懸浮液）：2ml，1mg×5支/袋，批號(hào)：317935。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組：將48只大鼠飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為正常組、哮喘組、腎氣虛哮喘組（腎哮組）、中藥組、西藥組、中西藥組（中西組）共6組，每組各8只。

2.2 造模方法：分述如下。

2.2.1 正常組：實(shí)驗(yàn)的第1天和第8天予以生理鹽水1ml腹腔注射，第15天開始，每日給予30分鐘生理鹽水超聲霧化吸入，日1次，共14天。

2.2.2 哮喘造模：除正常組外，其他各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)方法如下：①實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，用含卵清蛋白100mg，氫氧化鋁干粉100mg的生理鹽水混合液1ml注入腹腔內(nèi)，使其致敏；②實(shí)驗(yàn)第15天開始，將大鼠放于大小為65cm×45cm×45cm的透明罩內(nèi)，以1%的卵清蛋白霧化吸入30分鐘，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù)激發(fā)至死亡。

2.2.3 腎氣虛造模：除正常組、哮喘組外，其他各組大鼠復(fù)合腎氣虛造模。具體方法：①實(shí)驗(yàn)第1天，每日上午于同一時(shí)間對(duì)大鼠進(jìn)行驚恐刺激，用梅花針叩擊大鼠背部（20次/分鐘），每次15分鐘；②每天下午讓大鼠負(fù)重游泳，先將冰袋放入深50cm的水槽中，待水溫降為16攝氏度時(shí)，分批次將尾部纏有重量為該大鼠體重10%保險(xiǎn)絲的大鼠放入水槽中，使大鼠游泳至力竭（大鼠鼻尖沒入水中10秒）。日1次，共14天。

2.3 給藥處理：中藥組、西藥組、中西組大鼠于實(shí)驗(yàn)第15天給藥。西藥組給予普米克令舒0.02%霧化吸入，中藥組給予2.0g/kg益腎喘寧湯灌胃，中西組給予中藥2.0g/kg灌胃、西藥普米克令舒0.02%霧化吸入。

2.4 樣本采集與處理：①血清采集：各組大鼠于干預(yù)后第15天處理，腹主動(dòng)脈取血（10ml/只），靜置4小時(shí)后，1500rpm離心15分鐘，取上層血清，置-20℃冰箱備用；②脾臟采集：將脾臟取出，PBS沖洗組織后去除筋膜和結(jié)締組織，置-80℃冰箱備用。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)：分述如下。

2.5.1 腎氣虛證候相關(guān)檢測(cè)：血清睪酮（T）、血清甲狀腺素（T4）、血清皮質(zhì)醇（COR）均使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。

2.5.2 脾臟流式檢測(cè)：①大鼠脾臟單細(xì)胞懸液制備：用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗研磨脾臟細(xì)胞，1000rpm/min離心10min；加3倍體積紅細(xì)胞裂解液室溫下孵育5～10min，1000rpm/min離心10min；棄上清液，加RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，制成單細(xì)胞懸液。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脾臟Th17細(xì)胞的表達(dá)：激活：取2×106/ml脾臟單細(xì)胞懸液，在24孔板中每孔加入1ml細(xì)胞懸液，按比例加入PMA25μg/L，放入CO2培養(yǎng)箱中，孵育5h；胞外染色：取106/100μl細(xì)胞懸液至流式管中，加入Th17抗體，混勻，在4℃條件下避光孵育30min，1000rpm/min離心10min；破膜：在細(xì)胞懸液中加入已備好的預(yù)熱至37℃的BD CytofixTM Fixation Buffer 250ul，37℃下孵育15min，再加入-20℃的破膜劑Phosflow Perm Buffer 500ul，4℃避光孵育 20～30min；24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以±s表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腎氣虛證候相關(guān)性指標(biāo)檢測(cè)：腎氣虛哮喘組大鼠的T、T4、COR含量均低于正常組（P＜0.05），結(jié)合一般情況提示腎氣虛證哮喘造模成功。具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測(cè)定比較(±s，n=8）

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測(cè)定比較(±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與腎哮組比較，#P＜0.05。

正常組哮喘組腎哮組中西組西藥組中藥組141.29±3.45 141.45±4.62 52.31±6.2*127.36±7.53#107.23±6.31#112.42±3.25#95.47±6.32 84.00±6.0 48.32±1.4*84.22±4.07#56.38±3.08#68.04±4.19#78.41±1.48 75.61±1.92 65.29±2.73*73.00±3.57#68.08±2.67#70.36±1.97#

3.2 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠脾臟Th17細(xì)胞水平變化情況：見表2。

表2 各組大鼠脾臟Th17表達(dá)情況比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠脾臟Th17表達(dá)情況比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，#P＜0.05；與腎哮組比較，△P＜0.05；☆交互效應(yīng)檢驗(yàn)P＜0.05

4 討論

益腎喘寧湯由七味都?xì)馔杓游抖?，用沉香、旋?fù)花沉降之性，納氣平喘；取黃芪補(bǔ)氣而專固肌表[7]、升陽扶正之效；苦參、黛蛤散、天漿殼清肺化痰止咳。全方升中有降，補(bǔ)瀉兼施，諸藥合用，調(diào)和氣機(jī)，有補(bǔ)腎、納氣、平喘之功。Th17細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞新亞群，其分泌的細(xì)胞因子IL-17有強(qiáng)大的促炎作用，能夠募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞釋放炎性因子,從而增加氣道的高反應(yīng)性,促使氣道炎癥的發(fā)生[5]。同時(shí)，Th17還能誘導(dǎo)細(xì)胞活化，促進(jìn)氣道組織纖維化從而使氣道重塑發(fā)生哮喘[6]。本研究結(jié)果顯示，哮喘組及腎哮組大鼠脾臟中的Th17細(xì)胞百分比高于正常組，由此我們可以推測(cè)，Th17細(xì)胞可促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生，可能與哮喘發(fā)病相關(guān)。而中藥組、西藥組、中西組中大鼠Th17細(xì)胞比例較模型組降低，其中中西組Th17細(xì)胞數(shù)值下調(diào)最多。由此可見益腎喘寧湯與布地奈德均能有效降低機(jī)體內(nèi)Th17細(xì)胞值，從而抑制炎癥細(xì)胞的增多，降低氣道炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療哮喘的效果，且中西藥結(jié)合干預(yù)的作用最明顯。

[1]Emma S Chambers,Alexandra M Nanzer,Paul E Pfeffer,et al.Distinct endotypes of steroid-resistant asthma characterized by IL-17A(high)and IFN-γ(high)immunoph-enotypes：Potential benefits of calcitriol［J］.JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2015，382(3)：628-637

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[4]倪偉,于素霞,王宏長(zhǎng),等.緩解期哮喘患者腎陽虛與氣道炎癥關(guān)系的研究——附175例病例分析［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2001,7(6)：60-61.

[5]王國(guó)營(yíng).參蛤青龍湯治療支氣管哮喘68例臨床觀察［J］.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2013，27(11)：17-19.

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