孫曼鈺，彭太兵，何士成，賈士儒，鐘 成

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院／工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，同時(shí)也是地球上數(shù)量最多的生物質(zhì)資源，植物每年通過光合作用產(chǎn)生約1.55×1011t纖維素類物質(zhì)，僅我國農(nóng)作物秸稈量就達(dá)6億多t。目前，自然界中只有小部分纖維素得到了利用，絕大多數(shù)纖維素被浪費(fèi)并造成環(huán)境污染。產(chǎn)量巨大的木質(zhì)纖維材料的主要組成成分為糖類和芳香族化合物，可以將它們降解轉(zhuǎn)化為各種燃料、化學(xué)品和材料。利用化工和微生物技術(shù)等手段將其中一部分轉(zhuǎn)化為燃料、飼料、化工原料等，這一系列的舉措可以緩解資源不足等難題，并對環(huán)境的保護(hù)做出巨大貢獻(xiàn)。因此，利用工業(yè)技術(shù)和生物質(zhì)生產(chǎn)燃料、化學(xué)品和材料等大宗產(chǎn)品，具有重要的理論意義和較高的社會價(jià)值［1］。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為糖，并進(jìn)一步發(fā)酵生成乙醇等化工原料，對開發(fā)新能源、保護(hù)環(huán)境有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3部分組成，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較為復(fù)雜。半纖維素通過氫鍵與纖維素相連，其側(cè)鏈通過阿魏酸或醛酸與木素相連，半纖維素與木素將纖維素包裹起來，形成難以被微生物降解的聚合體［2］。由于纖維素本身高度結(jié)晶，難以被纖維素酶水解，使得纖維素乙醇加工過程變得困難。一般情況下，可以通過部分水解木質(zhì)素和半纖維素，破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，通過糖化酶（纖維素酶與半纖維素酶）水解纖維素和半纖維素，再通過微生物對己糖、戊糖進(jìn)行發(fā)酵，得到所需的最終產(chǎn)物乙醇。纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的多酶組分的復(fù)合酶系，是一類酶的總稱。不僅微生物可以產(chǎn)生纖維素酶，昆蟲、軟體動物、原生動物等也能產(chǎn)生纖維素酶。

纖維素生物質(zhì)的乙醇生產(chǎn)涉及5個(gè)單元的操作：預(yù)處理、纖維素酶的生產(chǎn)、酶水解、微生物發(fā)酵、產(chǎn)品回收，具體見圖1［3］。纖維素生產(chǎn)生物乙醇的過程一般有4種方式：單獨(dú)水解和發(fā)酵（separate hydrolysis and fermentation，SHF）、同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）、同步糖化共發(fā)酵（simultaneous saccharification and cofermentation，SSCF）、聯(lián) 合 生 物 加 工 技 術(shù) （consolidated bioprocessing，CBP）［4］。然而妨礙木質(zhì)纖維素資源化的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在實(shí)用化過程中的障礙之一是由于纖維素酶的生產(chǎn)效率低、成本較高。在工業(yè)應(yīng)用中，木質(zhì)纖維素降解為葡萄糖至少需要3種不同的纖維素酶［5］：外切纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶以及β－葡萄糖苷酶。目前使用的纖維素酶活力較低、單位原料用酶量大、酶解效率低，產(chǎn)酶和酶解技術(shù)都需要改進(jìn)。在目前的產(chǎn)酶技術(shù)條件下，生產(chǎn)3.97 L乙醇需用纖維素酶的生產(chǎn)費(fèi)用為30～50美分。由于酶的價(jià)格比較昂貴，纖維素酶的花費(fèi)占纖維素產(chǎn)乙醇成本的主要部分。為了減少酶的花費(fèi)，聯(lián)合生物加工工藝（consolidated bioprocessing，CBP）應(yīng)運(yùn)而生。即將纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)、水解和乙醇發(fā)酵組合或部分組合在一起完成［6］，這就要求纖維素酶生成和乙醇發(fā)酵都由1種微生物或1個(gè)微生物群體來施行。將產(chǎn)酶、糖化、己糖戊糖共發(fā)酵產(chǎn)生生物乙醇集合在1個(gè)反應(yīng)器內(nèi)，其工藝簡單，操作方便，能大幅度降低纖維素乙醇生產(chǎn)過程中的成本。

采用聯(lián)合生物加工技術(shù)生產(chǎn)乙醇，目前可以朝2條途徑進(jìn)行：（1）在產(chǎn)乙醇的過程中，使用能產(chǎn)纖維素酶且能發(fā)酵產(chǎn)乙醇的雙功能單一菌株（如熱纖梭菌作為出發(fā)株）進(jìn)行末端產(chǎn)物（乙醇）代謝途徑的代謝工程；（2）通過基因工程使異源纖維素酶系統(tǒng)導(dǎo)入到一些生長較快、研究較為成熟的真菌表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，使之能夠在預(yù)處理的木質(zhì)纖維素上生長和發(fā)酵。

1 天然策略

自然界中的某些微生物：梭狀芽孢桿菌、尖孢鐮刀菌、鏈孢霉菌等都具有直接把生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的能力。目前，聯(lián)合生物技術(shù)利用的微生物中，尤其是真菌和一些嗜熱微生物，因具備耐高溫性質(zhì)，同時(shí)有著比中溫菌活性更強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶系的能力和更高效生產(chǎn)乙醇的途徑，成為近年來生物乙醇轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)菌株。嗜熱厭氧菌具有獨(dú)特的高纖維素和植物細(xì)胞壁溶解率［7］。嗜熱菌是一類生活在高溫環(huán)境（約50～110℃）中的微生物，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，可以在工業(yè)生產(chǎn)中的高溫條件下生長。不但降低了反應(yīng)系統(tǒng)的冷卻能耗，而且不易被中溫微生物污染，同時(shí)有利于乙醇的回收，所產(chǎn)生的酶制劑能夠在室溫長久保持活性，便于長期貯存。另外，大部分嗜熱菌對化學(xué)變性劑和在極端pH值環(huán)境下的耐受性較高，底物范圍較廣，能夠利用葡萄糖、戊糖、阿拉伯糖等生產(chǎn)乙醇（部分嗜熱菌可直接利用結(jié)晶纖維素）。此外，有些嗜熱菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的耐高溫酶可應(yīng)用于以植物自身作為生物反應(yīng)容器的酶解研究中。因此，嗜熱菌在纖維素乙醇領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)成為國際上新的技術(shù)制高點(diǎn)，前景廣闊。據(jù)報(bào)道，一些真菌像念珠菌、尖孢鐮刀菌、酒曲菌屬、木霉屬等能將纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇。這些菌含有2個(gè)生物合成系統(tǒng)：一個(gè)是在有氧條件下產(chǎn)生纖維素酶降解纖維素生產(chǎn)可溶性糖；另一個(gè)是在厭氧條件下生產(chǎn)其他副產(chǎn)物，如乙酸等。表1總結(jié)了不同真菌利用纖維素產(chǎn)乙醇的情況［8］。目前研究最為廣泛的有熱纖梭菌，還有宛氏擬青霉、尖孢鐮刀菌和里氏木霉。

1.1 熱纖梭菌

據(jù)研究報(bào)道，熱纖梭菌是目前研究最多的嚴(yán)格厭氧嗜熱菌。嗜熱厭氧的熱纖梭菌可以迅速水解纖維素，達(dá)到2.5 g／（L·h）［13］。野生型菌株產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)率理論最大值達(dá)到10%～30%［14］。熱纖梭菌革蘭氏染色呈陽性、周生鞭毛、能運(yùn)動、芽孢卵圓形、端生，該菌培養(yǎng)溫度為50～60℃。能發(fā)酵纖維素和纖維糊精產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸、氫和二氧化碳，不能發(fā)酵戊糖和淀粉，有人把該菌不能在木糖上生長作為它的一個(gè)鑒別特性。熱纖梭菌不論接種物的碳源是纖維二糖還是葡萄糖，相比纖維二糖，熱纖梭菌在葡萄糖上生長的滯留期更長，生長在纖維二糖上的熱纖梭菌生長量幾乎為生長在葡萄糖上的2倍。

熱纖梭菌通過它的一種胞外纖維素酶復(fù)合體降解纖維素，該復(fù)合體由幾種具有不同底物專一性和不同水解機(jī)制的特異蛋白質(zhì)組成，其中較重要的有活性較強(qiáng)的內(nèi)葡聚糖酶（β－1，4糖苷鍵水解酶）。它可以斷裂內(nèi)切葡聚糖苷鍵，同時(shí)也可以水解短鏈低聚物（聚合度DP≥4）［15］。

該復(fù)合物也具有很弱的外葡聚糖酶活性，能夠從纖維素的還原末端水解纖維二糖的單位。但與大多數(shù)分解纖維素的微生物不同，熱纖梭菌不是通過纖維二糖酶的作用將纖維二糖分解成葡萄糖，而是通過纖維二糖磷酸化酶的作用將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖－1－磷酸和葡萄糖。熱纖梭菌通過纖維二糖磷酸化酶和纖維糊精磷酸化酶吸收纖維素的水解產(chǎn)物纖維糊精［15］。熱纖梭菌原始纖維素酶復(fù)合體還具有明顯的木聚糖酶活性。

熱纖梭菌在發(fā)酵過程中纖維素被降解成還原糖、乙醇等產(chǎn)物。在發(fā)酵前3 d，纖維素降解，還原糖和乙醇生成都非常迅速，到4 d變化趨勢較緩。纖維素由開始的10.00 g／L降到1.10 g／L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 89%。發(fā)酵液中乙醇含量達(dá)到1.07 g／L。目前，從發(fā)酵工藝角度看，熱纖梭菌利用纖維素產(chǎn)乙醇存在3個(gè)問題［16］：（1）乙醇產(chǎn)率較低。由于碳水化合物發(fā)酵不完全（還原性糖類積累）和乙酸、乳酸、氫的形成，使得乙醇的產(chǎn)量較低。（2）由于纖維素發(fā)酵速度慢，細(xì)胞生成量低由此而引起的纖維素酶效價(jià)低，造成容積生產(chǎn)力較低。（3）終產(chǎn)物乙醇及有機(jī)酸對細(xì)胞有相當(dāng)大的毒性。為解決這些問題，大多數(shù)的研究是與另一種不分解纖維素的嗜熱厭氧菌進(jìn)行共培養(yǎng)，該菌能利用熱纖梭菌分解纖維素時(shí)所產(chǎn)生的游離單糖產(chǎn)生乙醇。已測試過的能在共培養(yǎng)體系中增加乙醇產(chǎn)率的微生物有：嗜熱硫化氫梭菌、嗜熱解糖梭菌、乙醇嗜熱厭氧桿菌等。這些菌不僅生長的條件與熱纖梭菌相似，而且不分解纖維素，還可以發(fā)酵產(chǎn)生還原糖，使得乙醇產(chǎn)率提高。通過比較熱纖梭菌單獨(dú)培養(yǎng)和將其與嗜熱硫化氫梭菌共培養(yǎng)發(fā)酵的幾種纖維素基質(zhì)的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)乙醇含量比單獨(dú)發(fā)酵時(shí)要高，還原糖積累量比單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)要少。

表1 直接利用纖維素產(chǎn)乙醇的幾種真菌

1.2 宛氏擬青霉

宛氏擬青霉很早就引起了人們的廣泛關(guān)注，不僅是因?yàn)樗且环N次生代謝產(chǎn)物的來源，同時(shí)它可以產(chǎn)生各種各樣的酶，能夠有效地將纖維素分解生產(chǎn)高價(jià)值的生物制品［17］，但在CBP過程中的潛力還很少被研究。宛氏擬青霉是絲狀真菌，它的生物技術(shù)的應(yīng)用及其產(chǎn)生酶和新化合物的能力較強(qiáng)。它的代謝潛力尤其是包括一個(gè)經(jīng)典的單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)以及通過連續(xù)發(fā)酵工藝制造，都已經(jīng)用于動物飼料工業(yè)。它還被用于環(huán)萜類化合物和芳香醛的還原及廢水的脫毒。宛氏擬青霉是全球分布最廣的真菌類群，不受季節(jié)和地域的限制，是自然界生物量和生物多樣性的重要組成部分，屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、絲孢科中的1個(gè)屬。菌落白色、淡粉紅色、紫丁香色、黃褐色或臟灰褐色，偶爾帶有淺綠色調(diào)，但不會是真正的綠色，呈質(zhì)地緊密的氈狀、棉絮狀或索狀，少數(shù)呈濕潤或黏質(zhì)狀。

宛氏擬青霉可以產(chǎn)生纖維素酶，纖維素通過他們的木質(zhì)素降解酶降解成還原糖，然后經(jīng)過真菌發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)換成高附加值產(chǎn)品如生物乙醇［18］。Zerva等利用宛氏擬青霉菌ATHUM 8891通過CBP的方法利用纖維素生產(chǎn)生物乙醇［19］。宛氏擬青霉在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH值為6，121℃滅菌20 min。同時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基所需的碳源和氮源，接種的濃度為5×105個(gè)／mL。在29℃、180 r／min條件下培養(yǎng)5～7 d。取樣、離心（13 000 r／min，10 min）、過濾，取上清液測定乙醇和糖的濃度。通過試驗(yàn)可以證實(shí)，該菌能有效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵生成乙醇，且接近理論最大值。同時(shí)，氮的含量極大程度影響了乙醇的產(chǎn)量，該真菌能夠有效發(fā)酵葡萄糖和木糖。此外，真菌具有木質(zhì)纖維素降解酶的必要工廠。值得注意的是，宛氏擬青霉對木糖發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量高于葡萄糖，而葡萄糖－木糖混合物中沒有觀察到共發(fā)酵?？偟膩碚f，筆者所在實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明，宛氏擬青霉是一種新的可能和趨勢。

1.3 尖孢鐮刀菌

尖孢鐮刀菌是一種絲狀真菌。尖孢鐮刀菌是少數(shù)微生物物種所具有的分解纖維素和半纖維素的酶系統(tǒng)，而且對它的纖維素分解系統(tǒng)的各個(gè)成分有較具體的研究［20］，同時(shí)可以發(fā)酵己糖和戊糖產(chǎn)生乙醇。尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍廣泛。在PDA平板上培養(yǎng)，菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密。菌落粉白色、淺粉色至肉色，略帶有紫色，由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)。菌落高3～5 mm，小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團(tuán)，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔。厚垣孢子尖生或頂生，球形。尖孢鐮刀菌致病菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物維管束系統(tǒng)導(dǎo)致植物萎蔫枯死。尖孢鐮刀菌的強(qiáng)致病性與其所產(chǎn)纖維素酶有密切關(guān)系。由于植物病原菌通過滲入外細(xì)胞層和侵入不同的植物組織而感染宿主，感染期間病原菌會完全破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的纖維素等多聚物，對纖維素降解能力很強(qiáng)，因此對該菌纖維素降解系統(tǒng)的研究最初是基于防治的目的。隨著研究的深入，尖孢鐮刀菌高產(chǎn)纖維素酶的性能逐漸被認(rèn)識。其所產(chǎn)纖維素酶為胞外酶，且酶系完全。但目前對尖孢鐮刀菌纖維素酶的研究集中在防治植物枯萎病方面，對其所產(chǎn)纖維素酶的應(yīng)用方面的研究十分少見［21］。

有研究表明，尖孢鐮刀菌在咪唑類離子液體處理中所產(chǎn)生的纖維素酶量更多，且可以直接通過聯(lián)合生物技術(shù)將咪唑類離子液體處理過的水稻秸稈轉(zhuǎn)化成生物乙醇，在最佳的發(fā)酵條件下，可以產(chǎn) 0.125 g／g生物乙醇，理論產(chǎn)量達(dá)到64.2%［22］。范金霞等研究了尖孢鐮刀菌利用不同碳源生產(chǎn)乙醇的情況（表2）［23］。在葡萄糖單糖發(fā)酵中，葡萄糖消耗速率為 0.248 g／（L·h），最大乙醇產(chǎn)量為 8.50 g／L，最大菌體干質(zhì)量為 4.67 g／L，發(fā)酵周期為 3 d。

表2 尖孢鐮刀菌利用不同碳源生產(chǎn)乙醇

在木糖單糖發(fā)酵中，木糖消耗速率為0.159 g／（L·h），最大乙醇產(chǎn)量為5.77 g／L，最大菌體干質(zhì)量為6.18 g／L，發(fā)酵周期為7 d；在葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵中，葡萄糖優(yōu)先被利用且葡萄糖利用速率比木糖的高。通過對尖孢鐮刀菌產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行研究，篩選出酶活較高的菌株，分析其所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)，并進(jìn)行一定的產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化，以及對其潛在的工業(yè)利用價(jià)值進(jìn)行初步的探索。

1.4 里氏木霉

里氏木霉是一種好氧的絲狀真菌，為多細(xì)胞真核微生物，菌絲層較厚，致密叢束狀，初期為白色平坦，后期因產(chǎn)生分生孢子而呈深綠色，產(chǎn)孢區(qū)常排列成同心輪紋狀。菌落背面無色，有時(shí)呈淺黃色。菌絲透明、有隔，細(xì)胞壁光滑，分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，分枝多，對生或互生二至三級分枝，整體像樹枝；分枝與分生孢子梗近似直角，末端為小梗。小梗瓶形，分生孢子球形或長橢圓形，表面粗糙，布滿小刺；單胞，靠黏液在小梗上聚集成球狀綠色的分生孢子頭。以里氏木霉為出發(fā)菌種，經(jīng)初篩、復(fù)篩、誘變后，固態(tài)法發(fā)酵或液體深層培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，其分泌的纖維素酶是胞外酶，經(jīng)初提和分離純化就可得到纖維素酶制劑。里氏木霉具有一套完整的降解纖維素的酶系，研究表明里氏木霉所分泌的纖維素酶具有產(chǎn)酶量高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的纖維素酶。眾多研究表明，其分泌的纖維素酶是由三大酶體系所組成的酶復(fù)合體：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶（CBHⅠ）和β－葡萄糖苷酶。外切葡聚糖酶是里氏木霉表達(dá)最多的纖維素酶，也是最主要的纖維素酶［24］。里氏木霉主要表達(dá)2種外切葡聚糖酶：CBHⅠ和CBHⅡ。此外，里氏木霉所分泌的β－葡萄糖苷酶很少，但β－葡萄糖苷酶是主要限制分解纖維素降解的因素。

白合超等通過分批補(bǔ)料，采用間接出酶的方法，對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行研究［25］。分批補(bǔ)料過程中最佳的補(bǔ)料速度為5.5 g／（L·d），此條件下產(chǎn)酶第 8天濾紙酶活力和β－葡萄糖苷酶活力分別達(dá)到14.40、1.59 U／mL。在分批補(bǔ)料的基礎(chǔ)上進(jìn)行間歇出酶，與對照相比，第4、6、8天出酶模式時(shí)，總濾紙酶活力提高18.14%；第4、7天出酶模式時(shí)，總濾紙酶活力提高17.75%；第5、8天出酶模式時(shí)，總濾紙酶活力提高27.35%。研究表明，通過間歇出酶可以有效提高纖維素酶總濾紙酶的活力［25］。纖維素酶可以應(yīng)用于果蔬業(yè)、釀酒業(yè)和紡織加工等行業(yè)。篩選高效纖維素分解菌，確定纖維素酶的發(fā)酵條件，是利用稻草、秸稈、稻殼中纖維素的關(guān)鍵。

2 合成CBP微生物

20世紀(jì)80年代以來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)已用來克隆、表達(dá)具有較高酶活的纖維素酶。與誘變育種相比，利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行菌種選育具有良好的定向性。大多數(shù)真菌的纖維素酶產(chǎn)量高但生長慢，可以將真菌的纖維素酶基因?qū)氲揭恍┥L較快研究較為成熟的真菌表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以得到高的纖維素酶產(chǎn)量。其實(shí)質(zhì)主要是構(gòu)建異源酶系統(tǒng)，使得預(yù)處理的纖維素能夠同時(shí)分解和發(fā)酵。而目前在這種水平的已表達(dá)的蛋白主要有釀酒酵母和大腸桿菌。表3總結(jié)了酵母菌和大腸桿菌利用幾種不同底物為原料生產(chǎn)乙醇的情況。

表3 2種菌利用幾種不同底物為原料生產(chǎn)乙醇情況

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌可以說是重組蛋白生產(chǎn)中最常見的宿主菌。大腸含有利用五碳糖的所有必需酶，但厭氧條件下發(fā)酵形成的產(chǎn)物很復(fù)雜，乙醇只是其中很少的一部分。最后生成乙醇的階段是由丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶Ⅱ（ADH）催化完成的。大腸桿菌缺乏PDC，而且APH的表達(dá)水平也很低，最終代謝產(chǎn)物中乙醇含量極低。所以于梁將PDC和ADH基因的重組載體PET－AP成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，構(gòu)建導(dǎo)入PDC和ADH基因的工程菌，將丙酮酸到乙醇的代謝途徑導(dǎo)入到大腸桿菌中，利用構(gòu)建的基因工程菌大腸桿菌（E.coli SWZX426）將五碳糖發(fā)酵生成乙醇［31］。E.coli SWZX426成功地在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了丙酮酸脫羧代謝途徑；同時(shí)增強(qiáng)了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶的活力，使得乙醇成為構(gòu)建工程菌的主要代謝產(chǎn)物。通過對初始pH值、溫度、通氣量和轉(zhuǎn)速的進(jìn)一步優(yōu)化，E.coli SWZX426在發(fā)酵20 g／L葡萄糖時(shí)，發(fā)酵72 h后乙醇含量為6.4 g／L；發(fā)酵 20 g／L木糖時(shí)，發(fā)酵72 h后乙醇含量為4.8 g／L；木糖發(fā)酵的乙醇含量低于葡萄糖發(fā)酵的乙醇含量。該菌在發(fā)酵混合糖（含葡萄糖15 g／L和木糖 5 g／L）時(shí)，發(fā)酵 72 h后乙醇含量為 5.7 g／L。

Luo等通過結(jié)合從雙向運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中得到的丙酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因（ADHB），與大腸桿菌JM109結(jié)合構(gòu)建了具有產(chǎn)乙醇能力的大腸桿菌ZY81［32］。然后，β－葡萄糖苷酶表達(dá)基因bglB在ZY81上分泌表達(dá)，重組菌株大腸桿菌ZY81／bglB的胞外酶活力顯著增強(qiáng)。同時(shí)乙二胺四乙酸（EDTA）可以有效促進(jìn)細(xì)胞周質(zhì)蛋白的釋放，該重組菌株利用纖維素二糖作為唯一的碳源可以使生產(chǎn)乙醇的理論產(chǎn)量達(dá)到33.99%。

為了提高木質(zhì)纖維素材料的利用率，基因工程改造的大腸桿菌菌株也可以用于甜菜渣等木質(zhì)纖維素含量高的原材料。Edwards等成功地構(gòu)建了具有纖維二糖發(fā)酵和果膠降解能力的大腸桿菌KO11，該重組菌株能夠穩(wěn)定表達(dá)染色體整合的PDC和乙醇脫氫酶（ADHB）［33］，果膠甲酯酶對部分果膠的有效降解，使得最終乙醇的產(chǎn)量提高。

2.2 釀酒酵母

釀酒酵母是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具有許多優(yōu)良的生產(chǎn)性能，如在厭氧條件下有較好的生長能力，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生較高的乙醇得率和生產(chǎn)速率，具有較高的耐受乙醇和其他抑制物的性能。釀酒酵母遺傳背景清晰，基因水平的改造可操作性強(qiáng)，并且具有生長速率快、對抑制劑耐受性強(qiáng)等優(yōu)勢，被公認(rèn)為最具潛力的CBP乙醇生產(chǎn)菌株［34］。將釀酒酵母作為統(tǒng)合生物加工載體的主要要求是在釀酒酵母中高效分泌表達(dá)木質(zhì)纖維素水解酶。外源基因在釀酒酵母中的表達(dá)是釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的關(guān)鍵，其影響因素有外源基因的序列特性、拷貝數(shù)、對酵母細(xì)胞生命活動的影響、受體菌分泌途徑及分泌過程中蛋白質(zhì)的正確加工等。

Yamada等通過控制3種纖維素酶的表達(dá)水平來構(gòu)建重組釀酒酵母菌株，采用混合整體化的方法優(yōu)化纖維素酶的活性［35］。通過構(gòu)建重組菌株，其中包含6份外切葡聚糖酶、16份內(nèi)切葡聚糖酶和1份β－葡聚糖苷酶。20 g／L原料可以產(chǎn)生3.1 g／L乙醇。到目前為止，來自真菌和細(xì)菌的纖維素酶已成功異源表達(dá)為多酶復(fù)合體。酵母菌株中的纖維素酶基因大都來自真菌，特別是里氏木霉。許多真菌的纖維素酶產(chǎn)量高但生長慢，可以將真菌的纖維素酶基因?qū)氲揭恍┥L較快研究較為成熟的真菌表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，以得到高的纖維素酶產(chǎn)量。湯新等將從里氏木霉中分離到的eg4基因（內(nèi)切葡萄糖苷酶基因）與畢赤酵母表達(dá)載體pPlCZ連接，得到重組質(zhì)粒pPICZαA－eg4［36］。將該重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，eg4基因經(jīng)過同源重組被整合到畢赤酵母的染色體上，并處于酵母α因子的下游，得到重組菌株 P.pastoris EGlV l，培養(yǎng)液的酶活力達(dá)到 2.11 U／mL。

Treebupachatsakul等通過將里氏木霉中的CeI3B基因和棘孢曲霉中的AaBGL1基因構(gòu)成重組表達(dá)體，然后在釀酒酵母中表達(dá)［37］。重組蛋白可以提高β－葡萄糖苷酶的活力，對于糖的轉(zhuǎn)化具有重要作用。AaBGL1在釀酒酵母中的表達(dá)有效地提高了乙醇的含量。

雖然釀酒酵母具有能將各種類型的纖維素發(fā)酵成乙醇的潛力，但它不能利用包含在半纖維素中的木糖。因此，通常將木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）2種基因引入釀酒酵母菌株中，此外，釀酒酵母的內(nèi)源性XK基因的表達(dá)也可以增加木糖的利用效率［38］。筆者所在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為木質(zhì)纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程實(shí)質(zhì)上是通過一種微生物將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵過程組合或部分組合，在釀酒酵母中共表達(dá)CBP酵母所需要的所有外源基因是不太容易實(shí)現(xiàn)的，不僅會增加細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，而且釀酒酵母代謝己糖和戊糖的能力也有可能受到影響。如果根據(jù)特定微生物產(chǎn)生纖維素酶系的某些不足，將不足組分酶的基因在釀酒酵母中高效表達(dá)，配合使用相應(yīng)酶系的酶制劑，也是釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的一個(gè)策略，能在一定程度上減少成本［39］。

3 總結(jié)

在生產(chǎn)生物乙醇的過程中，使用能產(chǎn)纖維素酶且能發(fā)酵產(chǎn)乙醇的雙功能單一菌株，或者通過基因工程將異源纖維素酶系統(tǒng)導(dǎo)入到一些生長較快研究較為成熟的真菌表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，是目前國內(nèi)外聯(lián)合生物加工木質(zhì)素生產(chǎn)生物乙醇的主要研究方向。聯(lián)合生物加工由于其工藝上的高度整合，有效節(jié)省了原料和時(shí)間，迎合了未來生物質(zhì)能源生產(chǎn)發(fā)展的趨勢。近年來，通過試驗(yàn)研究，證明了2個(gè)策略的可行性，積極開發(fā)出了利用纖維素的微生物和其他發(fā)酵物，使得預(yù)處理的生物質(zhì)得到高速率和高轉(zhuǎn)化率，并產(chǎn)生所需的高產(chǎn)量和效價(jià)。通過將相對于低成本的可再生生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料以及各種工業(yè)化學(xué)品，從而實(shí)現(xiàn)社會效益低成本轉(zhuǎn)換的質(zhì)的飛躍。因此，聯(lián)合生物加工木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的前景一片光明。

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