范東海，趙麗麗，常桂英

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

植物內(nèi)生菌是指生活史的某一或全部時期生活于健康植物體內(nèi)，而又不引起寄主植物明顯病害癥狀的細(xì)菌或真菌，它與植物在長期的進(jìn)化過程中形成了互惠共生相互依存的關(guān)系［1］。

烏腺金絲桃（Hypericum attenuatum）別稱穩(wěn)心草、趕山鞭，屬于植物界、被子植物門、木蘭綱、山茶目、藤黃科（Guttiferae）金絲桃屬（Hypericum）植物［2］，作為中草藥在民間廣為使用。高度0.3～0.7 m，有發(fā)達(dá)的側(cè)根和須根。莖豎直生長，植株上有許多黑色斑點分散生長，因而得名烏腺金絲桃。烏腺金絲桃葉片呈長卵形，花瓣五瓣、黃色，生長在植物頂端，果實深棕色、卵圓形，種子為細(xì)長的小圓柱形。一般在每年的7—8月間開花，在8—9月間結(jié)果。烏腺金絲桃大多分布在潮濕的小山丘、土坡、山腳路邊的草叢、草原、石礫地、林地及其周圍，廣泛生長于中國黑龍江、吉林、遼寧及內(nèi)蒙古等地區(qū)。金絲桃屬植物的化學(xué)成分研究結(jié)果表明，該屬植物主要含有二蒽酮類、黃酮類、間苯三酚類和芳香酸類［3－4］化合物等化學(xué)成分，具有抗菌消炎、收斂止血以及治療黃疸、肝炎及瘡癤腫毒的作用，對心律失常、心肌缺血、心衰和增強(qiáng)免疫力等具有較好的功效，同時還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒等活性［5］。尤其是其中的黃酮成分對心律失常、心肌缺血、心衰、抑郁等心血管疾病具有很強(qiáng)的藥理活性。研究采用根段直接培養(yǎng)法［6］，將傳統(tǒng)形態(tài)分類與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對烏腺金絲桃根部真菌進(jìn)行分離、鑒定，旨在為開展植物真菌研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

烏腺金絲桃全草（采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院烏腺金絲桃栽培基地）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 乙醇（分析純），氯化汞（分析純），液氮，二甲苯（分析純），PDA配方：馬鈴薯200 g、水1 L、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH值自然。

1.2.2 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3751L－PC，松下健康醫(yī)療器械株式會社）；超凈工作臺（SW－CJ－ZFD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；智能光照培養(yǎng)箱（PGX－350A，喬楓實業(yè)有限公司）；冰箱（BCD－221TMBA，青島海爾股份有限公司）；高速離心機(jī)（HC－2514，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；PCR擴(kuò)增儀（THERM－1000，美國AXYGEN公司）；電泳儀（JY600，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（Image Quant LAS500，美國通用電氣）。

1.3 方法與準(zhǔn)備

1.3.1 材料的預(yù)處理 取健壯的纖細(xì)根用自來水沖洗干凈，剪成1～2 cm段長。

1.3.2 消毒方法和時間選擇 75%乙醇消毒30 s→無菌水沖洗3～4次→無菌濾紙吸干→0.1%氯化汞消毒1 min→無菌水清洗3～4次→無菌濾紙吸干

1.3.3 菌株的分離與純化 將處理好的根段置于PDA培養(yǎng)基上，每皿接4段，10個重復(fù)，于25℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲從根段的橫切面長出，并圍繞根段生長形成菌落后，挑取尖端菌絲接于培養(yǎng)基中，純化。純化后的菌株轉(zhuǎn)接在試管斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱內(nèi)保存，備用。同時將最后1次無菌水沖洗液涂布于培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)，作為對照判斷表面消毒是否徹底。

1.3.4 內(nèi)生真菌種屬鑒定 對分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，根據(jù)其菌絲體顏色、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及有無橫隔等特征，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定［7－8］。除形態(tài)學(xué)鑒定外，通過分子生物學(xué)手段，通過擴(kuò)增分析真菌rDNA的ITS序列，對其進(jìn)行分子鑒定。

1.3.5 菌根真菌基因組DNA的提取 用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［9］提取真菌基因組DNA，在用酚－三氯甲烷提取前單獨用酚抽提1次，除去蛋白質(zhì)。

1.3.5.1 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測 選用的引物序列為：ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCG－3′；ITS4：5′－TCCTCCGCTTA TTGATATGC－3′。用于 ITS擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系見表1。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃后延伸10 min，45個循環(huán)；72℃延伸30 s。

表1 ITS擴(kuò)增的PCR 50μL反應(yīng)體系

1.3.5.2 鑒定 取 5μL PCR產(chǎn)物，用 1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，由北京華大基因研究中心進(jìn)行測序。

1.3.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將獲得的菌根真菌的ITS全序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，選擇同源性較高的序列。使用ClustalX1.81軟件對篩選出的序列進(jìn)行全序列多重比對，用MEGA5.1軟件計算遺傳距離，并以相應(yīng)的種屬為外群進(jìn)一步采用N－J法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果 （1）烏腺金絲桃醇溶物的提?。翰烧獮跸俳鸾z桃全草，洗凈，將其干燥，80%乙醇浸提 12 h，收集醇溶液［10－12］，提取浸膏，干燥，用真空冷凍抽濾機(jī)干燥得結(jié)晶物，置于－40℃下儲存，備用。（2）供試菌液的制備：LB培養(yǎng)基的配制與滅菌→細(xì)菌的活化（37℃、24 h）→配制菌懸液備用。（3）濾紙片法抑菌效果測定：制備4種濃度分別為2、4、6、8 mg／mL的烏腺金絲桃醇溶物。采用濾紙片法，將直徑為10 mm的濾紙片滅菌后，分別浸泡于各濃度胞外粗提物溶液中2 h，分別吸取0.4 mL各供試菌懸液涂布于培養(yǎng)皿上，且以無菌生理鹽水組作對照。每個處理3個重復(fù)，置于37℃條件下培養(yǎng)24 h，測量各供試菌在不同濃度下的抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基觀察結(jié)果

從烏腺金絲桃根中分離出1株于PDA培養(yǎng)基上生長良好的優(yōu)勢菌株，編號A85276。由圖1、圖2可知，菌落棉絮狀，菌絲緊密生長，正面中部呈淺黃色，邊緣呈白色；后期邊緣呈粉紅色，波浪狀。菌絲有隔，分枝，孢子呈圓柱形。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由所得的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）與編號菌株A85276相似度很高，而且處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分枝上，可證明所分離得到的菌株為三線鐮刀菌。

表2 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果

2.3 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌作用

由表2可見，烏腺金絲桃醇溶物的濃度越高，烏腺金絲桃醇溶物的抑菌圈直徑整體越大，說明胞外粗提物的濃度與抑菌效果呈正相關(guān)關(guān)系；同時，沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑比較長，而四聯(lián)球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑與革蘭氏陰性菌相比較短?？赡艿脑蚴歉锾m氏陽性菌能產(chǎn)生外毒素，在菌體開始生長的階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，外毒素含量高，對烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用強(qiáng)，產(chǎn)生的抑菌效果不明顯；革蘭氏陰性菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素，在菌體生長階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，也有少量衰亡、死亡的細(xì)胞會釋放出內(nèi)毒素，但含量低，對烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用弱，產(chǎn)生的抑菌效果明顯。

3 結(jié)論與討論

采用根段直接培養(yǎng)法分離烏腺金絲桃內(nèi)生真菌，在形態(tài)、分子鑒定的基礎(chǔ)上，將來自藥用植物烏腺金絲桃根部的1株內(nèi)生真菌鑒定為三線鐮刀菌。其對烏腺金絲桃的生長產(chǎn)生的影響還需要進(jìn)一步研究。抑菌試驗表明，烏腺金絲桃醇溶物對細(xì)菌有抑制作用，并與醇溶物濃度呈正相關(guān)，推測其醇溶物中可能含有抑制細(xì)菌生長的化學(xué)成分，未來可能在生物防治等方面提供作用。

綜上所述，菌根研究的不斷壯大，在一定程度上可豐富其他相關(guān)學(xué)科的內(nèi)容，并促進(jìn)其發(fā)展。特別是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，基于學(xué)科之間的聯(lián)合、相互滲透的大趨勢，菌根研究對其他相關(guān)學(xué)科的進(jìn)展將發(fā)揮越來越大的作用。

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