王 錦，馬善波，李 龍，唐俊峰，楊志福，石小鵬，文愛東，曹金一*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032)

咽炎顆粒[蘭制字(2011)F68094]處方由菊花、金銀花和甘草等8味藥組成，具有清熱解毒、滋陰降火和潤燥利咽的功效。用于急、慢性咽炎[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要檢測項(xiàng)目僅有綠原酸和甘草的TLC鑒別[2-4]，不能很好地對該中成藥進(jìn)行質(zhì)量控制。為了進(jìn)一步滿足質(zhì)量控制[5-7]的要求，在本次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的工作中，我們對原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和提高，在原有基礎(chǔ)上，增加了處方中的菊花的TLC鑒別，同時(shí)還增加了菊花和金銀花中總的綠原酸的含量測定TLC，從而可更好地控制其質(zhì)量。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高在很大程度上增加了對產(chǎn)品質(zhì)量的可控性[8-10]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；Sartorius CPA225D電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))；UV-2600 紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；ZF-2型紫外光燈分析儀(上海安亭電子儀器廠)；UPDR-11-20L超純水機(jī)(西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 咽炎顆粒：西京醫(yī)院藥劑科(批號:150205，150104，150206)。陰性對照：缺菊花、金銀花陰性樣品，缺菊花陰性樣品(西京醫(yī)院藥劑科提供，均按照咽炎顆粒工藝制成)；綠原酸對照品(批號110753-201415，供含量測定用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)，菊花對照藥材(批號121384-201103)，均由中國食品藥品檢定研究所提供；乙腈(色譜純，默克化工上海技術(shù)公司)；超純水；硅膠G(青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)，TLC色譜用)；聚酰胺薄膜(浙江臺州市路橋四甲生化塑料硬廠)；正己烷、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、石油醚(60～90 ℃)、乙酸、石油醚(30～60 ℃)、甲苯、苯、三氯甲烷、鹽酸、甲醇、乙醇、三氯化鋁和三氯化鐵，均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1菊花的TLC鑒別 取咽炎顆粒30 g，研細(xì)，置于100 mL錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使其溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。精密稱取菊花[11-13]對照藥材1 g，加稀鹽酸1 mL和乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，蒸干濾液，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對照藥材溶液。取陰性對照樣品30 g，按照上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

參照TLC法，(《中國藥典》2015年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，分別吸取上述陰性對照溶液、3批咽炎顆粒供試品溶液和對照藥材溶液5，5和2 μL，依次點(diǎn)于同一硅膠G板上，以7∶4∶0.5比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈365 nm下檢視。菊花對照藥材與陰性對照相應(yīng)的位置無相同斑點(diǎn)，表示無干擾;在供試品溶液色譜中，與菊花對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色大小的熒光斑點(diǎn)。故將此法列入新提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，見圖1。

圖1TLC圖

1.陰性對照溶液；2～4.咽炎顆粒供試品；5.菊花對照藥材。

Fig.1 TLC chromatograms

1.negative control sample；2-4.sample of Pharyngitis Granules；5.Chrysanthemumcontrol.

2.2菊花和金銀花中綠原酸的含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜條件ECOSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液=13∶87；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：328 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按照綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液:取綠原酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的溶液，即得。

供試品溶液：取咽炎顆粒2 g，研細(xì)，置于50 mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇35 mL，超聲處理40 min，放冷，搖勻，濾過，移至50 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇定容至刻度，即得。

陰性樣品溶液:取缺菊花[14-15]和金銀花[16-17]的陰性對照樣品2 g，按照上述供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取綠原酸[18-20]對照品溶液，以甲醇為空白對照，在280～350 nm范圍掃描，綠原酸的最大吸收波長為328 nm。

按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件，將上述制備好的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，分別注入高效液相色譜儀測定，結(jié)果顯示，供試品溶液在與對照品溶液相同保留時(shí)間處有一致的色譜峰，陰性對照溶液在與對照品溶液相同保留時(shí)間處無吸收峰。見圖2。

圖2HPLC圖

A.綠原酸對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.綠原酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.chlorogenic acid control sample；B.sample;C.negative sample；1.chlorogenic acid.

2.2.4線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對照品11.15 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解制成質(zhì)量濃度為111.5 μg·mL-1的對照品溶液。精密吸取此對照品溶液各2，4，6，8和10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，得回歸方程(含量測定)y=3 051.035 8x+17 842.50；r=0.999 8。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在214.526～1 072.63 ng之間線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為111.5 μg·mL-1的綠原酸對照品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄綠原酸的峰面積，結(jié)果RSD值為0.42%(n=5)，結(jié)果表明，色譜儀精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下咽炎顆粒供試品溶液(批號150205)，分別于0，3，6，9和12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得RSD值為0.95%(n=5)，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次咽炎顆粒樣品(批號150205)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份平行供試品溶液，按照擬定的含量測定方法，對綠原酸進(jìn)行含量測定，計(jì)算結(jié)果顯示，綠原酸的平均含量為1 367.28 μg·g-1，RSD值為1.8%(n=5)，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好。

2.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的咽炎顆粒樣品(批號150205，綠原酸含量1 367.28 μg·g-1)6份，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。取咽炎顆粒1 g，研細(xì)，精密稱定，加入綠原酸對照品溶液15 mL (質(zhì)量濃度為111.5 μg·mL-1)，按照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備。各精密吸取10 μL，進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率為98.1%，RSD值為1.9%(n=5)。結(jié)果表明，本含量測定方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

表1綠原酸加樣回收率測定結(jié)果

Tab1.Results of the recovery rate of chlorogenic acid

序號取樣量/g原有綠原酸量/μg加入綠原酸量/μg測得綠原酸總量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%11．01371386．0121608．9452952．56597．3798．11．921．02021394．8991608．9452961．71097．3831．01491387．6521608．9452947．05596．9241．01871392．8481608．9452943．54596．3851．02441400．6421608．9453032．270101．4161．02091395．8561608．9452996．49599．48

2.2.9樣品含量測定 取咽炎顆粒樣品3批(批號：150205，150104，150206)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行取樣2份，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，每份測定2次，計(jì)算綠原酸含量分別為21.8，21.7和21.5 mg·袋-1。

3 討論

在TLC實(shí)驗(yàn)中，菊花的鑒別為新增項(xiàng)目，根據(jù)咽炎顆粒標(biāo)準(zhǔn)提高技術(shù)要求，對咽炎顆粒中的菊花進(jìn)行了TLC方法研究。用石油醚提取后，分別比較了用甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(2∶30∶2∶2∶4)上層液；苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)；甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.5)，預(yù)飽和10 min；甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶4∶0.5)為展開劑，均發(fā)現(xiàn)分離效果不理想或顯色斑點(diǎn)不清晰；又用甲醇和乙酸乙酯提取后，用以上展開劑分別實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最終確定了以甲醇和乙酸乙酯提取，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶4∶0.5)為展開劑，分離度好，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性對照無干擾。

HPLC法測定金銀花與菊花中綠原酸總含量在本實(shí)驗(yàn)中為新增項(xiàng)目。用HPLC法測定金銀花與菊花中綠原酸總含量來進(jìn)行質(zhì)量控制，可以更全面地反映咽炎顆粒的質(zhì)量，從而更好地對其質(zhì)量進(jìn)行控制。

本實(shí)驗(yàn)所建立的方法，可作為咽炎顆粒的檢測方法納入新提升的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，符合《軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高技術(shù)要求》。

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