趙 霞 ，王長彪 ，趙興華 ，劉 江 ，韓 斌 ，任永康 ，牛瑜琦 ，唐朝暉

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，山西太原030031）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上重要的糧食作物之一[1]。近幾年，小麥病害發(fā)生嚴重，如白粉病、各種銹病等，抗病育種一直是育種家們的研究內(nèi)容，因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥新品種勢在必行[2-3]。傳統(tǒng)的育種方式費工費時，從分子水平改良種質(zhì)資源的方式正一步步受到人們的重視[4]。近年來，分子標記技術[5]在小麥研究中取得重大進展[6]。

生物信息學綜合應用生物學知識、數(shù)學模型及計算機運算，對核酸序列和蛋白質(zhì)進行研究，旨在獲得具有生物學意義的信息[7]。隨著生物信息學技術的快速發(fā)展，基因的電子定位發(fā)展了起來[8]，其是利用日益豐富的生物信息學資源，運用生物信息學方法，將目的基因定位到染色體實際位置上的一種技術，較傳統(tǒng)的定位技術更簡便、更快捷、成本更低[9]。分子生物學與生物信息學技術的結合為小麥的研究提供了有效的方法[10]。

本研究旨在尋找與小麥抗白粉病、抗銹病相關的SSR和STS標記，構建小麥抗病分子標記數(shù)據(jù)庫，并將其定位在中國春小麥的全基因組數(shù)據(jù)庫中，把抗病標記進行物理定位，為基因精細定位、克隆基因等方面奠定基礎。然后對能夠成功定位的基因進行有效的序列分析、功能預測、功能注釋及KEGG分析等生物信息學研究，以期獲得與小麥白粉菌、銹菌互作進程中的基因表達信息，為研究小麥病害的發(fā)病機理、發(fā)掘抗病相關新基因及抗病基因的精細定位和分子標記輔助育種奠定基礎，對進一步培育抗病小麥品種具有重要的理論實踐意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的51份小麥材料中，41份由山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供，分別是運旱618、運旱 20410、石家莊 8 號、SY-9571、良星 99、良星 66、濟麥 22、山農(nóng) 20、百農(nóng) 64、蘭考 906、保豐 104、揚麥 21、中麥 247、皖麥 38、中麥 175、舜麥 1718、京冬 8 號、MY559、周麥 28、周麥 30、周麥 32、京冬17、京冬 18、京冬 24、長 4640、長 6135、長 6452、長6878、太 5902、太 10604、晉麥 66、晉麥 70、晉麥84、晉太 170、晉太 182、寧麥 5 號、石麥 15、濟南17、洛旱2號、河農(nóng)6425、中優(yōu)9507；3份由山東農(nóng)業(yè)大學提供，分別是 98M71，UC1041，Moro；7 份由西北農(nóng)林科技大學提供，分別是先麥12、豐尤8號、百農(nóng) 121、鄭 132、鄭 369、蘭考 165、阜 0608。

從相關文獻中查找小麥抗白粉病、抗銹病相關標記，共368個。

1.2 方法

小麥抗病基因定位：在Linux平臺上，將368個抗病標記采用re-PCR方法將其定位到中國春小麥全基因組序列中，統(tǒng)計結果并利用MapChart2.1軟件進行作圖。

使用Fgenesh軟件對能進行電子定位的序列進行功能基因預測。使用Blast2go軟件對獲得的功能基因進行基因的GO注釋及KEGG的代謝通路分析。

從預測出的功能基因中隨機選取159對引物進行真實PCR檢測。采用CTAB法提取小麥幼苗葉片DNA，隨后用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度，再進行 PCR反應（10 μL 體系：1.5 μL 50 ng模板 DNA，1 μL 10×buffer，0.2 mol/L dNTP，0.12 U Taq聚合酶，0.75 μmol/L引物），反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火45 s（退火溫度據(jù)引物溫度而定，一般55～60℃），72℃延伸45 s，共35個循環(huán)。最后用8%非變性聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行分離檢測，上樣2 μL并在220 V電壓下運行1 h后，銀染后統(tǒng)計結果，讀帶后利用NTSYS軟件的UPGMA聚類分析法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，探究遺傳規(guī)律。

2 結果與分析

2.1 電子定位結果

統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)，共有247個與抗病相關的基因被定位到了相應染色體上，其中定位到2B染色體上的最多。同時發(fā)現(xiàn)，有的同一個標記定位在不同染色體上或同一個標記在同一條染色體的不同部位。具體對分子標記的電子定位效果進行統(tǒng)計，其中，在1A染色體上的分子標記定位率（定位率即成功進行電子定位后每條染色體上的總標記與未定位前每條染色體上的總標記的百分比）為60%，1B為 65.5%，1D為 72.7%，2A 為 57.9%，2B 為 64.3%，2D 為 82.1% ，3A 為 55.6% ，3B 為 66.7% ，3D 為12.5%，4A 為 84.6%，4B 為 80.0%，4D 為 38.5%，5A為 37.5%，5B 為 69.2%，5D為 89.5%，6A 為 91.7%，6B 為 40.0% ，6D 為 6.7% ，7A 為 50.0% ，7B 為51.7%，7D為90.9%。電子定位的結果表明，電子定位能夠為抗病基因的克隆、表達和功能研究等提供重要的信息，也可為進一步研究小麥抗病機制等提供基礎數(shù)據(jù)。

2.2 小麥基因功能預測

將可以成功進行定位的247個小麥抗病基因利用基因功能預測軟件Fgenesh進行基因預測，共預測出108個功能基因。

2.3 小麥功能基因的序列分析

將所得的108個基因的核酸序列用Blast2go軟件進行功能注釋分類，其中，成功注釋的有73個功能基因，未成功注釋的有35個功能基因。共得到89條GO術語信息，其中，屬于生物學途徑P的有51條，細胞組件C的23條，分子功能F的有15條。GO注釋分類的結果表明，在生物學途徑中最多的是生物過程與細胞過程，其次就是各種代謝過程，如有機物代謝過程、細胞代謝過程、初級代謝過程、大分子代謝過程等；從細胞組成的角度來看，大多數(shù)功能基因都是在細胞、胞內(nèi)、細胞器及細胞質(zhì)中起作用的；在分子功能中，作用最多的是分子功能，其次是催化活性和結合功能，充分說明小麥細胞內(nèi)正?；顒与x不開包括輔基結合、蛋白結合、輔酶結合、ATP結合、DNA結合和RNA結合等各種結合功能及酶的催化活性。

2.4 基于KEGG的代謝通路分析

運用KEGG數(shù)據(jù)庫對獲得的功能基因進行代謝通路分析，共有16個功能基因編碼的13種酶涉及到11個生物化學途徑。相關的酶有差向異構酶、硝基苯磷酸酯酶、轉化酶、α-葡萄糖苷酶、二磷酸合酶、水解酶、磷酸酶、磷酸合酶。參與的生物化學途徑有戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、氨基苯甲酸鹽降解、淀粉和蔗糖代謝、萜類骨架生物合成、脂肪酸伸長率、光合生物固碳、Th1和Th2細胞分化、T細胞受體信號通路、半乳糖代謝、磷酸戊糖途徑、抗生素生物合成。本研究認為，在小麥的各種代謝途徑中，主要以淀粉、蔗糖代謝為主。具體代謝分析結果列于表1。

表1 小麥功能基因基于KEGG的代謝通路分析

2.5 聚類分析

構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，從結果可以看出，其遺傳相似系數(shù)為 0.66～0.90，平均為 0.78。從圖1可看出，濟麥22和山農(nóng)20親緣關系最近。在相似系數(shù)為0.75時，可以把51份材料分為Ⅸ大類，其中，第Ⅰ類中運旱618與運旱20410是高感病品種，可以推測與其聚在一起的有可能是高感病品種；第Ⅲ類中大部分品種都是高抗品種[11-15]；第Ⅳ類中除了MY559是高抗葉銹病品種外[16]，其余都是來自西北農(nóng)林科技大學的高抗條銹病與高抗白粉病的品種[17]；第Ⅵ類中SY-9571是感病品種[11]；第Ⅷ類與第Ⅸ類都是長麥系列。以上聚類信息為小麥抗病基因標記在小麥品種鑒定中的應用提供了理論依據(jù)，是小麥品種在分子水平上表現(xiàn)出的遺傳多樣性，為小麥多種品種共同抗病奠定了基礎。

3 結論

種業(yè)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的源頭，發(fā)展小麥種業(yè)是保障我國糧食安全的根本[18]。由于長期的人工選擇和栽培，導致小麥大量優(yōu)異基因丟失，導致當今小麥遺傳基礎狹窄、脆弱，易受病蟲害的侵染，限制了小麥產(chǎn)量的提高[19]。本研究通過電子定位技術將368個小麥抗病標記定位到中國春小麥全基因組序列中[20]，并利用Fgenesh，Blast2go軟件以及KEGG等生物信息學手段對小麥抗病基因進行生物信息學分析，這些為小麥的抗病育種提供了一定的理論依據(jù)。隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，基因工程抗病育種和分子輔助抗病育種正在逐步變?yōu)楝F(xiàn)實，這些對加快和促進小麥抗病育種、培育小麥優(yōu)良品種具有重要意義[21-22]。多基因聚合育種可以避免單一抗性品種抗性喪失帶來的危險，且可以獲得持久抗性，因此，在今后也可以通過多基因聚合來克服栽培品種抗性過快喪失這一難題[23]。

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