樊 迎，陳 毅，薛霖莉，連文綺，張 丹

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800）

海紅果的學(xué)名為西府海棠，又稱海紅子、子母海棠等，屬薔薇科梨亞科蘋(píng)果屬[1-2]，具有諸多經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其果實(shí)完全成熟后外觀呈現(xiàn)紫紅色，果肉為淡紅色，果肉脆且多汁，果實(shí)比較小，果型近似圓形。

白藜蘆醇的化學(xué)名為3，4，5-三羥基二苯乙烯，屬于單寧質(zhì)多酚，在水中的溶解度較低，易溶于有機(jī)溶劑[3]。在自然界中，白藜蘆醇廣泛存在于天然植物或果實(shí)中，如葡萄、花生、虎杖、松樹(shù)和決明子等[4]。至今，已至少在21科31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)有白藜蘆醇[5]。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，既具有獨(dú)特的生物活性又具有其植物多酚的一部分共性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行較深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇還具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集以及調(diào)節(jié)血脂代謝，保持血液暢通，降低血液黏稠度等廣泛的有益于人類健康的生理藥理學(xué)作用[6-9]。丁勇[10]用反相液相色譜法檢測(cè)了海紅果酒中白藜蘆醇的含量為144.9 μg/L，但是直接從海紅果中提取白藜蘆醇還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以酶法處理、乙醇提取海紅果干粉中的白藜蘆醇，并進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定其最佳提取條件，旨在為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選無(wú)病蟲(chóng)害的完整海紅果（產(chǎn)自內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗沙圪堵鎮(zhèn)）熟果，將果實(shí)清洗干凈，除去果核，放置于陰涼處風(fēng)干，然后粉碎，在恒溫60℃條件下烘干，過(guò)0.42 mm篩后備用。

1.2 試劑與儀器

白藜蘆醇標(biāo)品（純度＞98%），成都曼斯特生物科技有限公司；纖維素酶（酶活力單位約10000U/g），寧夏和氏璧生物科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；電子天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；酸度計(jì)（PHS-25，上海雷磁精密儀器有限公司）；電熱恒溫水箱（SSW-420-2S，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取和檢測(cè)方法[11]準(zhǔn)確稱取2.000 g海紅果干粉若干份，置于錐形瓶中。固定初始條件為：溫度50℃，纖維素酶添加量為100mg/g，酶解時(shí)間90 min。然后各加入40 mL預(yù)先用雙蒸水配制的不同pH值（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）的檸檬酸 - 檸檬酸鈉緩沖溶液、一定量的纖維素酶（60，80，100，120，140mg/g），在一定的酶解溫度（35，40，45，50，55 ℃）下水解一定時(shí)間（30，60，90，120，150 min），以考察 pH值、纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間這4個(gè)單因素對(duì)白藜蘆醇提取量的影響。酶解完成后，過(guò)濾，殘?jiān)骷尤?0 mL（料液比1∶30）體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液作為提取劑，在75℃的恒溫條件下提取4 h，期間保持多次搖晃，使充分接觸。最后，過(guò)濾除去雜質(zhì)取得濾液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在白藜蘆醇的檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm處對(duì)濾液進(jìn)行檢測(cè)，得到濾液吸光度值，代入線性回歸方程中進(jìn)行計(jì)算，并求出其含量。每個(gè)處理均取3份樣品進(jìn)行平行操作，結(jié)果取平均值。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）及纖維素酶添加量（D）4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平（L9（34））正交試驗(yàn)。

1.3.2 白藜蘆醇含量測(cè)定方法[12]將不同質(zhì)量的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶解于體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以80%乙醇溶液為參比，于306 nm處測(cè)定該系列標(biāo)液的吸光度值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：

其中，Y為吸光度值，ρ為白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取白藜蘆醇的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解pH值對(duì)白藜蘆醇產(chǎn)量的影響 由圖1可知，pH值在 4.0～4.5 時(shí)，隨著 pH值增加，白藜蘆醇產(chǎn)量急劇升高；當(dāng)pH值在4.5～5.5時(shí)，白藜蘆醇的產(chǎn)量變化不大；且隨著pH值繼續(xù)升高，其產(chǎn)量卻略有下降。故選pH值4.5～5.0為合適的酶解條件。

2.1.2 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇產(chǎn)量的影響 由圖2可知，在酶解溫度為35～50℃時(shí)，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，白藜蘆醇的提取產(chǎn)量達(dá)到最高；當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，產(chǎn)量減小，有可能是因?yàn)闇囟忍咂茐牧嗣傅幕钚浴Ｋ?，選擇50℃為適宜的酶解溫度。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇產(chǎn)量的影響 由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間為30～120 min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的逐漸增加，白藜蘆醇的產(chǎn)量也在升高，當(dāng)酶解時(shí)間為120 min時(shí)，白藜蘆醇的產(chǎn)量最高；隨著酶解時(shí)間增加為150 min時(shí)，白藜蘆醇的產(chǎn)量幾乎不再增加。從節(jié)約時(shí)間方面考慮，選擇酶解時(shí)間120 min為最佳酶解時(shí)間。

2.1.4 纖維素酶添加量對(duì)白藜蘆醇產(chǎn)量的影響由圖4可知，當(dāng)纖維素酶添加量為60～120 mg/g時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，白藜蘆醇的產(chǎn)量平穩(wěn)增長(zhǎng)；當(dāng)纖維素酶的添加量為120 mg/g時(shí)，白藜蘆醇產(chǎn)量最高；當(dāng)纖維素酶添加量增加至140 mg/g時(shí)，白藜蘆醇產(chǎn)量反而下降。所以，選擇纖維素酶添加量120 mg/g為適宜的纖維素酶添加量。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）及纖維素酶添加量（D）這4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)（表1）。其極差分析、方差分析結(jié)果分別列于表2，3。

表1 正交試驗(yàn)的因素及水平

從表2可以看出，比較纖維素酶法提取白藜蘆醇的4個(gè)主要影響因素（A，B，C，D）的極差 R值，可得到影響因素的主次排序?yàn)椋篈＞B＞C＞D，即酶解pH（A）的影響最大，其次依次是酶解溫度（B）和酶解時(shí)間（C），影響最小的是纖維素酶添加量（D）。經(jīng)分析，較優(yōu)組合為 A2B2C2D2，分別是 pH值 4.75、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間120 min，纖維素酶添加量120 mg/g。

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

由表 3可知，酶解 pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）三者對(duì)海紅果干粉中白藜蘆醇提取的影響極顯著（P＜0.01），而纖維素酶添加量（D）的影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

采用正交優(yōu)化試驗(yàn)所得到的最優(yōu)試驗(yàn)水平組合A2B2C2D2，并用其進(jìn)行白藜蘆醇的酶解及提取試驗(yàn)，平行操作3次，得到白藜蘆醇的含量平均值為114.37 μg/g，與之前的試驗(yàn)結(jié)果吻合良好，說(shuō)明該工藝條件較為可靠，并具有穩(wěn)定的再現(xiàn)性。同時(shí)，作為對(duì)比，也測(cè)定了不用纖維素酶處理而直接用料液比1∶30的80%乙醇溶液在75℃條件下提取4 h，得到的平均值為66.32 μg/g。說(shuō)明用纖維素酶處理破壞了細(xì)胞壁，有利于白藜蘆醇在乙醇中的溶出[13]，可明顯提高提取效率，白藜蘆醇的產(chǎn)量是直接用乙醇提取的1.72倍。

3 結(jié)論與討論

本研究先采用纖維素酶處理再用乙醇溶液浸提的方法來(lái)提取海紅果干粉中的白藜蘆醇，經(jīng)過(guò)單因素與正交試驗(yàn)的優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值4.75、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間120 min、纖維素酶添加量120 μg/g的條件下，白藜蘆醇的產(chǎn)量最高，可達(dá)到114.37 μg/g，是直接用乙醇提取的 1.72 倍，明顯提高了提取效率。

目前，白藜蘆醇的提取主要是以葡萄[14-15]、虎杖[16]、桑葚[17]、花生[18]以及它們的葉、皮、渣、籽等為原料，但是含量均較低（8～192 μg/g），限制了其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用程度。而且隨著國(guó)內(nèi)外食品、生物、日化等領(lǐng)域?qū)Π邹继J醇研究的逐漸深入，市場(chǎng)需求量也在不斷增加，現(xiàn)有產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足不斷增加的需求。因此，從其他植物中提取白藜蘆醇變得至關(guān)重要，且具有廣闊的市場(chǎng)前景。本研究所用的酶法輔助乙醇提取海紅果中的白藜蘆醇效果明顯，今后應(yīng)嘗試將這種方法應(yīng)用到多種植物白藜蘆醇的提取中。

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