李澤康，盧勉飛,，蔡芷荷，陳博，吳清平，萬(wàn)強(qiáng)

藥品無(wú)菌檢查法是一個(gè)定性檢查，是用于檢查《中國(guó)藥典》要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法[1]。培養(yǎng)基是無(wú)菌檢查的基礎(chǔ)，其對(duì)微生物具有廣譜的促生長(zhǎng)能力和高度的檢測(cè)敏感性。為此，各國(guó)藥典無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基都處在一個(gè)不斷改進(jìn)的發(fā)展過(guò)程。

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FT）是中國(guó)藥典2015年版所規(guī)定藥品無(wú)菌檢查用的培養(yǎng)基之一，同時(shí)也是目前國(guó)際藥典（美國(guó)藥典、歐洲藥典等）收載的藥品無(wú)菌檢查檢測(cè)厭氧菌的特定培養(yǎng)基，同時(shí)此培養(yǎng)基也可用于需氣菌的培養(yǎng)[2-7]。

由于商品化干燥培養(yǎng)基在生產(chǎn)過(guò)程中受原材料產(chǎn)地、質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等因素的影響，導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定性和檢測(cè)性能隨之發(fā)生改變，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能產(chǎn)生直接的影響[3]。在我們的檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)前的FT培養(yǎng)基在配制過(guò)程中，如果未完全煮溶就分裝或分裝時(shí)未搖勻，在滅菌后或14天的培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)少量的混濁現(xiàn)象，混濁的培養(yǎng)液很容易引起結(jié)果的誤判。這主要與配方中含有少量的瓊脂粉有關(guān)，溶解于培養(yǎng)基質(zhì)的瓊脂透明度和分散均勻度欠佳。基于已有的研究經(jīng)驗(yàn)，我們針對(duì)FT培養(yǎng)基存在的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)將改進(jìn)產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)產(chǎn)品比較的效果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 改進(jìn)前硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（HK-1）；改良硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（HK-2）；其他3個(gè)國(guó)內(nèi)廠家I、II、III各購(gòu)買(mǎi)了2批。胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基的制備 分別將不同廠家的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基按說(shuō)明書(shū)要求制備成10 ml/管的液體培養(yǎng)基，滅菌后備用。

1.3 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]和生抱梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]均購(gòu)自衛(wèi)生藥部品生物制品檢定所。

1.4 試驗(yàn)用菌懸液的制備 將上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌株分別接種于胰酪胨大豆瓊脂平板上，生孢梭菌菌株接種于血瓊脂平板上，均置（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，以0.9%無(wú)菌生理鹽水懸浮培養(yǎng)物，制備成約含活菌數(shù)10～100 CFU/ml的菌懸液，再以0.9%無(wú)菌生理鹽水稀釋成分別制成約含活菌數(shù)1～10 CFU/ml、0.1～1 CFU/ml和＜0.1 CFU/ml的菌懸液，備用；試驗(yàn)時(shí)以胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA分別計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌各劑量菌懸液的實(shí)際活菌數(shù)，以哥倫比亞瓊脂平板計(jì)數(shù)生孢梭菌各劑量菌懸液的實(shí)際活菌數(shù)。

上述試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)物均使用新鮮培養(yǎng)物，傳代次數(shù)不超過(guò)5代。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 培養(yǎng)基感官和pH值測(cè)定 培養(yǎng)基的配置均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別制備成10 ml/管的液體培養(yǎng)基和用三角瓶分裝500 ml，滅菌完畢后觀察培養(yǎng)基，記錄外觀特征。同時(shí)在25℃恒溫后用酸度計(jì)測(cè)定各培養(yǎng)基的pH值。

1.5.2 培養(yǎng)基的無(wú)菌試驗(yàn)及36℃恒溫培養(yǎng)后的外觀變化將已滅菌的500 ml三角瓶培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中（36±1）℃培養(yǎng)30 d，并逢第3、7、14天記錄培養(yǎng)基的外觀特征和是否有菌生長(zhǎng)，包括培養(yǎng)基色澤外觀、氧化層高度、是否有沉淀、是否有凝塊等。

1.5.3 半定量法 分別取上述不同劑量的試驗(yàn)菌株的菌懸液1 ml分別接種于受試的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管中，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后，輕輕振搖試管，同時(shí)與無(wú)生長(zhǎng)管（陰性管）對(duì)照，當(dāng)出現(xiàn)混濁時(shí)計(jì)為生長(zhǎng)管（陽(yáng)性管）。逐日觀察結(jié)果，連續(xù)觀察3 d，分別記錄不同接種劑量的受試培養(yǎng)基每天新增的生長(zhǎng)管數(shù)。每廠家受試培養(yǎng)基每稀釋度分別接種5管，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件General Linear Model檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)培養(yǎng)基的外觀情況比較 試驗(yàn)培養(yǎng)基的外觀情況比較見(jiàn)表1所示，HK-1、HK-2以及廠家I、II、III和參照中檢所的培養(yǎng)基均為淡黃色，也均無(wú)沉淀，但是在透明度方面有不同程度的差異，HK-2和廠家II的培養(yǎng)基透明清晰，而HK-1、廠家I和III以及中檢所參照均不透明，有少許渾濁。

表1 試驗(yàn)培養(yǎng)基的外觀情況Table 1 The appearance of the testmedium

2.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基的pH值比較 試驗(yàn)培養(yǎng)基的pH值比較見(jiàn)表2所示，根據(jù)中國(guó)藥典2015版可知，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基給出配方和pH值范圍。從表2可見(jiàn)，所測(cè)定的HK-1、HK-2以及廠家I、廠家II和中檢所的培養(yǎng)基均在標(biāo)準(zhǔn)的pH值范圍內(nèi)，只有廠家III的pH值稍低。

表2 試驗(yàn)培養(yǎng)基的pH值（25℃）Table 2 The pH of the testmedium(25℃)

2.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基在無(wú)菌試驗(yàn)后的情況 試驗(yàn)培養(yǎng)基在無(wú)菌試驗(yàn)后的變化情況見(jiàn)表3所示，6個(gè)受試的培養(yǎng)基在（36±1）℃培養(yǎng)14 d后均沒(méi)有被雜菌污染，也沒(méi)有凝塊產(chǎn)生或者凝固。在培養(yǎng)基透明度方面，HK-2和廠家II的培養(yǎng)基在14 d之前均能保持較高的透明度。然而，HK-1、廠家I、廠家III和中檢所的培養(yǎng)基透明度均比HK-2、廠家II的差，在14 d觀察期內(nèi)均不透明清澈，有少許渾濁。在氧化層高度方面，HK-1、HK-2、廠家Ⅰ、廠家Ⅱ、和中檢所的培養(yǎng)基在14 d內(nèi)均能保持為培養(yǎng)基深度的1/5；然而，廠家III的氧化層在7 d之后已占滿整瓶培養(yǎng)基。

2.4 試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落形態(tài)比較 試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落形態(tài)結(jié)果如表4所示，金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的菌落在HK-2和廠家II中均為顆粒狀生長(zhǎng)，而金黃色葡萄球菌在HK-1、廠家I、III和參照中檢所中均為長(zhǎng)條型生長(zhǎng)，生孢梭菌在HK-1、廠家I、III和參照中檢所中均為梭型生長(zhǎng)。銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在各個(gè)廠家中均為培養(yǎng)基表層混濁生長(zhǎng)。

表3 試驗(yàn)培養(yǎng)基在無(wú)菌試驗(yàn)后的變化情況Table 3 Change of the tested medium aftersteriling test

表4 各試驗(yàn)菌株在受試培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)比較Table 4 Comparison of the growth of each teststrain on the tested medium

2.5 試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度比較 試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度結(jié)果如表5所示，當(dāng)試驗(yàn)菌株的接種劑量為10～100 CFU/管和1～10 CFU/管時(shí)，各試驗(yàn)菌株在各受試培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)管數(shù)完全一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)試驗(yàn)菌株的接種量為0.1～1 CFU/管時(shí)，所有試驗(yàn)菌株在受試培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)管數(shù)比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

藥品的無(wú)菌檢查是以活的微生物為檢測(cè)對(duì)象[7]，培養(yǎng)基的質(zhì)量與穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響至為重要。本文選擇藥品無(wú)菌檢查中檢測(cè)厭氧菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基流體作為受試培養(yǎng)基，而選用的4株試驗(yàn)菌株均為課題合作組規(guī)定和提供的試驗(yàn)菌株[8]，也是中國(guó)藥典中用于無(wú)菌檢查培養(yǎng)基性能測(cè)試的試驗(yàn)菌株[9]。

培養(yǎng)基的理化指標(biāo)，包括外觀色澤、澄清度、pH值等，均是培養(yǎng)基性能的檢測(cè)項(xiàng)目之一。本文對(duì)改進(jìn)前后的及其他3個(gè)國(guó)內(nèi)廠家的受試培養(yǎng)基進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。在這5者的pH值測(cè)定中，只有廠家III的pH值低于標(biāo)準(zhǔn)范圍，其他3個(gè)廠家無(wú)明顯差異。然而，在透明度方面，4個(gè)廠家之間有差異，其中HK-2和廠家Ⅱ均為澄清透明無(wú)沉淀，而HK-1、廠家I、III和參照中檢所均為不透明，有少量渾濁。這些差異可能與廠家使用的瓊脂粉質(zhì)量不同有關(guān)。本培養(yǎng)基需要少量瓊脂（0.075%）[4]來(lái)降低培養(yǎng)基的內(nèi)部對(duì)流，即可以防止二氧化碳、氧氣和還原產(chǎn)物的擴(kuò)散，有利于厭氧環(huán)境的形成[3]。然而，由于含有瓊脂，在培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后便會(huì)形成一些不均勻分布的絮狀懸浮物，形成少許渾濁，培養(yǎng)基的透明度便會(huì)受影響。培養(yǎng)基透明程度高低會(huì)直接影響無(wú)菌檢查中菌落存在與否的判定以及菌落生長(zhǎng)形態(tài)的觀察，培養(yǎng)基透明度越高應(yīng)越有利于菌落生長(zhǎng)的觀察與判斷。

培養(yǎng)基的細(xì)菌學(xué)質(zhì)控（或稱“細(xì)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)”）是培養(yǎng)基質(zhì)量的性能試驗(yàn)，是培養(yǎng)基的內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)。它是用已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株按照規(guī)定的要求，測(cè)定培養(yǎng)基質(zhì)量是否符合微生物的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)需要，以便掌握培養(yǎng)基的靈敏度和準(zhǔn)確度[10]。在菌落生長(zhǎng)形態(tài)方面，金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的菌落在HK-2和廠家II中均為顆粒狀生長(zhǎng)，而金黃色葡萄球菌在HK-1、廠家I、III和參照中檢所中均為長(zhǎng)條型生長(zhǎng)，生孢梭菌在HK-1、廠家I、III和參照中檢所中均為梭型生長(zhǎng)。銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在各個(gè)廠家中均為培養(yǎng)基表層混濁生長(zhǎng)。這表明某些菌株在低透明度培養(yǎng)基（HK-1、廠家I、III）比在高透明度培養(yǎng)基（HK-2、廠家II）的更加擴(kuò)散性生長(zhǎng)，這與參照中檢所的結(jié)果相近。

培養(yǎng)基的靈敏度測(cè)試，是評(píng)價(jià)培養(yǎng)基性能的一個(gè)重要指標(biāo)[11]。在靈敏度實(shí)驗(yàn)方面，在4株試驗(yàn)菌株中，4個(gè)廠家的受試培養(yǎng)基在接種劑量為10～100 CFU/管或者0.1～1 CFU/管時(shí)均無(wú)顯著性差異，表明盡管不同廠家之間外觀或者透明度方面有差異，但是其生長(zhǎng)能力和靈敏度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這兩方面結(jié)果提示了盡管培養(yǎng)基的透明度有所不同，某些菌株的生長(zhǎng)形態(tài)有所區(qū)別，但是高透明度的培養(yǎng)基（HK-2、廠家II）其菌株的生長(zhǎng)能力和靈敏度水平也高，這兩方面均與參照中檢所以及HK-1、廠家I、III相當(dāng)。

綜上所述，本文所選擇的4個(gè)國(guó)內(nèi)廠家的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基對(duì)厭氧菌和需氧菌的檢測(cè)效果有差異。HK-2和廠家II的培養(yǎng)基透明度比HK-1、廠家I、III更高，但是菌落的生長(zhǎng)形態(tài)與這三者有差異。培養(yǎng)基透明度高低會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)形態(tài)，但不影響菌株的生長(zhǎng)能力和靈敏度水平，同時(shí)透明度高低會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察與判斷，在高透明度的情況下應(yīng)更有利于觀察菌落生長(zhǎng)。因此，在無(wú)菌檢查中，使用該培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)考慮到上述因素。

表5 各試驗(yàn)菌株在受試培養(yǎng)基上的靈敏度比較Table 5 Comparison of the sensitivity of each teststrain on the tested medium

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