姚元志，王志剛，張 亮，王 冬，李 芳*

(1.重慶市腫瘤醫(yī)院 重慶市腫瘤研究所 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，重慶 400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科,重慶 400016)

為提高疾病治愈率，高敏感、高精準(zhǔn)診療技術(shù)的應(yīng)用必不可少[1]。分子影像學(xué)技術(shù)在疾病早期診斷和靶向治療領(lǐng)域極具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景[2-3]。黑色素作為一種天然生物色素，具有特征性的光聲效應(yīng)和良好的生物相容性，是光聲成像的理想靶標(biāo)[4-5]。本研究以葉酸為靶針，磷脂高分子微粒為載體，制備包裹黑色素/阿霉素的多功能分子探針，觀察其體外尋靶和體外超聲、光聲顯像能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 磷脂PEG葉酸[DSPE-PEG(2000)Folate]、磷脂酰膽堿(DSPC)、磷脂酰乙醇胺(DPPE)、膽固醇(Avanti公司)、黑色素(Sigma公司)；C3F8(天津核工業(yè)理化工程研究所)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；XL2020聲震儀(美國Heat System Inc)；Malvern激光粒徑檢測儀(美國Zetesize公司)；UV-2500紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；正置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Mylab90彩色超聲診斷儀(意大利Esaote公司)；VevoRLAZR光聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics 公司)。

1.2 制備葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素多功能造影劑 稱取一定質(zhì)量比(10∶4∶3∶3)DSPC、DSPE-PEG(2000)Folate、DPPE、膽固醇溶于10 ml氯仿中，加熱待其完全溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,55℃減壓蒸發(fā)2 h去除溶劑，形成均勻脂質(zhì)膜后加入PBS水化；將2 mg黑色素加入2 ml氫氧化鈉溶液(pH=12)至其完全溶解后裝入透析袋(M=12 000 kD)，以稀鹽酸溶液調(diào)整其pH為7.4，后取2 mg阿霉素溶于黑色素溶液中，形成黑色素阿霉素溶液；冰浴條件下，采用聲振儀(脈沖式，功率100 W，時間10 min，工作10 s，暫停10 s)乳化脂質(zhì)溶液并逐滴加入黑色素阿霉素溶液，得到載阿霉素/黑色素葉酸靶向脂質(zhì)納米粒。在4℃條件下將載阿霉素/黑色素葉酸靶向脂質(zhì)納米粒多次離心洗滌(12 000轉(zhuǎn)/分，10 min)，以2 ml雙蒸水稀釋，冷凍干燥24 h后減壓充入C3F8氣體保存待用。另外上述制備過程中加入普通DPPE替代DSPE-PEG(2000)Folate，步驟同前，得到普通載黑色素/阿霉素脂質(zhì)納米粒。

1.3 基本性能檢測 雙蒸水稀釋葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素脂質(zhì)納米粒至適宜濃度，光鏡下觀察其分布和形態(tài)，以Malvern激光粒徑儀測量其粒徑、表面電位。采用阿霉素對照樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以紫外-可見光分光光度法測量阿霉素載藥量(最大吸收波長483 nm)。

1.4 體外細(xì)胞尋靶能力 體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，取對數(shù)期細(xì)胞，以1×104/孔接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，普通1 640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)液，加入無葉酸1 640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。將以上細(xì)胞分為3組：①靶向造影劑組，在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)DiI染色的葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素造影劑100 μl；②普通造影劑組，在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)DiI染色普通造影劑100 μl；③游離葉酸干預(yù)組，在培養(yǎng)皿中首先加入1 ml游離葉酸溶液(1 mol/L)封閉葉酸受體，再加入經(jīng)DiI染色的葉酸受體靶向造影劑100 μl。上述各組正常培養(yǎng)2 h后，采用4%多聚甲醛固定，加入DiO染料著色細(xì)胞膜5 min，用PBS液多次反復(fù)沖洗去除游離造影劑及染料，于激光共聚焦顯微鏡下觀察造影劑與細(xì)胞結(jié)合情況。

1.5 體外細(xì)胞毒性作用 將人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中(1×104/孔)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清1 640培養(yǎng)基，于全濕度培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)24 h后移除舊培養(yǎng)液，并分為阿霉素組、葉酸受體靶向造影劑組(阿霉素終濃度為0.2 μg/ml)及黑色素組、未載藥造影劑組(與葉酸受體靶向造影劑組相同比例稀釋)4組，以新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12 h、24 h和48 h。各組設(shè)置3個復(fù)孔，均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

每孔加入20 μl MTT液繼續(xù)孵育4 h，棄上清，再加入DMSO溶液150 μl，輕振10 min后，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長下檢測各孔吸光度(A值)。經(jīng)以下公式測得細(xì)胞活性：細(xì)胞存活率(%)=1-(阿霉素組/葉酸受體靶向造影劑組/黑色素組A值-空白A值)/(未載藥造影劑組A值-空白A值)×100%。

1.6 體外超聲、光聲雙模態(tài)顯像 采用瓊脂糖凝膠為模型，取少量造影劑用雙蒸水稀釋至1 mg/ml，以單純雙蒸水為對照組。采用醫(yī)用超聲診斷儀觀察基波及諧波模式下超聲顯影情況(LA523探頭，頻率4～13 MHz，增益70%，MI 0.12)，并采用超聲Flash輻照，作用3次后，繼續(xù)觀察其超聲顯影情況，并用超聲定量儀進(jìn)行定量分析。

取上述相同濃度造影劑于模型中，模型孔心距探頭<1 cm，以波長為700 nm脈沖激光輻照，以雙蒸水為對照，觀察其光聲成像情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葉酸受體靶向載藥造影劑的制備及其理化特性 本實(shí)驗(yàn)成功制備出葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素脂質(zhì)納米粒，形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散良好，外觀呈棕色(圖1、2)，粒徑為(659.60±27.56) nm，Zeta電位為(-38.90±4.00)mV。納米粒在4 ℃下可穩(wěn)定保存1周，冷凍干燥后充入C3F8氣體可保存1個月以上。測得阿霉素載藥量為85.72 μg/mg。

2.2 葉酸受體靶向造影劑體外靶向能力 在激光共聚焦顯微鏡下(圖3)，經(jīng)DiI染色造影劑外殼呈紅色，DiO染色細(xì)胞膜呈綠色。靶向造影劑組可見大量造影劑向MDA-MB-231細(xì)胞緊密聚集，在細(xì)胞表面較明顯，部分被細(xì)胞吞噬于胞內(nèi)；普通造影劑組和游離葉酸干預(yù)組未見或少見造影劑靶向聚集。

2.3 造影劑細(xì)胞毒性 阿霉素組和葉酸受體靶向造影劑組中，隨著孵育時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降；2組間不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。未載藥造影劑組與黑色素組不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，圖4)。

2.4 體外超聲、光聲雙模態(tài)顯像結(jié)果 葉酸受體靶向造影劑在超聲基波及諧波模式下均出現(xiàn)明顯超聲回波信號[灰階值強(qiáng)度分別為(63.25±4.52)dB和(41.64±3.14)dB],經(jīng)超聲Flash輻照后，超聲基波模式下回波信號[灰階值強(qiáng)度(38.51±2.62)dB]明顯降低(P<0.05)，而在諧波模式下超聲回聲信號基本消失[灰階值強(qiáng)度(2.29±0.68)dB，P<0.05；圖5]；對照組在超聲基波和諧波模式下均呈無回聲。造影劑在波長700 nm脈沖激光輻照下具有良好光聲成像效果，而對照組無光聲信號(圖6)，造影劑與雙蒸水的PA值分別為0.83 a.u和0.06 a.u(P<0.05)。

圖1 靶向造影劑光鏡圖(×1000) 圖2 靶向造影劑透射電鏡圖 圖3 造影劑體外尋靶的共聚焦圖(×600) A.靶向造影劑組； B.普通造影劑組； C.游離葉酸干預(yù)組 圖4 不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞的活性影響

圖5 葉酸受體靶向造影劑超聲成像 A.超聲Flash輻照前基波成像； B.超聲Flash輻照前諧波成像； C.超聲Flash輻照后基波成像； D.超聲Flash輻照后諧波成像

圖6 葉酸受體靶向造影劑光聲成像 A.超聲成像圖； B.光聲成像圖； C.超聲和光聲成像融合圖

3 討論

近年來，分子影像學(xué)的發(fā)展為腫瘤等重大疾病的早期診療提供了新手段[6-7]。超聲分子探針的發(fā)展為應(yīng)用超聲早期診斷、精準(zhǔn)治療以及超聲操控多功能診療提供了可能。以超聲造影劑為載體，聯(lián)合CT、MRI、核素、熒光成像劑，制備雙模態(tài)或多模態(tài)造影劑，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，提高疾病早期診斷率。由于造影劑各種成分的理化特性、生物安全性等因素，制備多模態(tài)造影劑仍需進(jìn)行安全風(fēng)險評估，并面臨制備工藝的挑戰(zhàn)。

超聲微泡粒徑大和載藥率低是其作為分子探針和藥物載體發(fā)展的瓶頸。超聲納泡粒徑小、穩(wěn)定性較好、體內(nèi)半衰期較長，能通過連接靶向介質(zhì)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位、靶點(diǎn)顯像的目的，攜帶基因、藥物等后可同時實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療[8-9]。Fan等[10]研究表明，超聲納泡與臨床應(yīng)用的聲諾維造影劑對增強(qiáng)超聲顯像具有較好的一致性。本課題組的前期研究[11]也證實(shí)脂質(zhì)納泡與聲諾維微泡具有相同HIFU增效作用。本實(shí)驗(yàn)通過冷凍干燥-真空充氣法制備葉酸受體靶向造影劑，在體外凝膠模型中證實(shí)了葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素造影劑具有較好的超聲成像能力。

光聲成像是近年來超聲多模態(tài)成像研究的熱點(diǎn)之一，目前對金納米粒子、碳納米材料及人造染料等光聲成像對比劑的研究最多[12]。黑色素廣泛存在于人體皮膚及毛發(fā)中，在紫外波長范圍內(nèi)具有強(qiáng)烈的光吸收能力，是一種天然、安全、有效的光聲成像對比劑[13]。本研究以黑色素為光聲成像對比劑核心，以超聲脂質(zhì)微泡為載體，葉酸為靶向，制備包裹治療藥物-阿霉素的多功能造影劑，在體外模型中初步證實(shí)了葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素多功能造影劑具有較好的主動靶向性能、細(xì)胞生物療效和超聲和光聲成像能力。研究[14-15]顯示，以超聲造影劑為載體，攜帶各種治療藥物或基因，通過超聲與造影劑作用的聲孔效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)治療藥物的局部釋放、減少全身不良反應(yīng)及提高基因轉(zhuǎn)染效率。

本研究的局限性：葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素多功能造影劑在體超聲顯像效果還有待證實(shí)；黑色素具有良好的光聲成像能力，尚需與目前研究熱門的金納米粒子、碳納米材料以及人造染料等光聲對比劑進(jìn)行對比評估；造影劑有待進(jìn)一步優(yōu)化制備和深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的葉酸受體靶向載阿霉素/黑色素多功能造影劑是集靶向治療、超聲和光聲多模態(tài)顯像于一體的多功能造影劑，有望成為乳腺癌精準(zhǔn)顯像和治療的理想分子探針。

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