喻 滔，黃曉玲*,曹 陽，陳瑜莉，冉海濤

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，超聲分子影像重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)利用光聲效應(yīng)成像，具有光學(xué)成像的高對(duì)比度和超聲成像的良好組織穿透力，能實(shí)時(shí)收集包括結(jié)構(gòu)、功能、代謝和分子信息在內(nèi)的多種生理病理數(shù)據(jù)[1-2]，且無輻射[3]。近年來對(duì)光聲成像的研究一方面是關(guān)于光聲成像技術(shù)方法的改進(jìn)及應(yīng)用[4-7]；另一方面是制備具有多種功能的造影劑，將光聲成像與治療方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)診療一體化[8-9]。目前常用光聲成像劑有金納米棒[10]和吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)。金納米棒價(jià)格昂貴；ICG是目前唯一被FDA批準(zhǔn)用于臨床的染料分子，但其穩(wěn)定性較差、體內(nèi)清除快。酞菁鋅(ZnPc)作為第二代光敏劑，具有光穩(wěn)定性好、光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)優(yōu)等優(yōu)勢(shì)，多用于光動(dòng)力學(xué)治療，但應(yīng)用于光聲成像的研究鮮見。研究[11]表明，某些侵襲性腫瘤如乳腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤的αvβ3整合素受體呈過度表達(dá)，具有RGD肽段的RGDfK作為腫瘤靶向肽，可與αvβ3整合素受體特異性結(jié)合，提高探針的腫瘤靶向性。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)， PLGA]為基材，通過雙乳化法及碳二亞胺法制備RGD靶向的載光敏劑ZnPc及化療藥物多烯紫杉醇(docetaxel, DTX)的多功能納米探針，觀察其光聲介導(dǎo)下誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人乳腺癌(MBA-MD-231)細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所)；PLGA-COOH(50∶50聚合比；濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；DTX(西安昊軒生物有限公司)；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA；Sigma)；ZnPc(Sigma)；FITC標(biāo)記的RGDfk肽[FITC-RGDfk；吉爾(生化)上海有限公司]；EDC/NHS(Sigma)；熒光染料DAPI、DiI。Sonics聲振儀；Malvern Zetasizer Nano ZS90激光電位及粒徑測(cè)量儀；Hitachi S-3400N電子顯微鏡；Shimadzu UV-2550紫外分光光度計(jì)；DIONEX ultimate 3000高效液相色譜分析儀；NikonA1+R激光共聚焦顯微鏡；Opotech Vibrant 355 Ⅱ HE光聲成像儀；BD Influx流式細(xì)胞分選儀。

1.2 載DTX及ZnPc的靶向PLGA納米探針制備 采用雙乳化法(O/W/O)制備載DTX及ZnPc的PLGA納米粒(PLGA@ZnPc@DTX)。稱取40 mg ZnPc，加入4 ml三氯甲烷中混勻，以5 000 rpm、離心5 min，取上液2 ml加入盛5 mg DTX及50 mg PLGA的EP管中，充分溶解后加入500 μl去離子水，冰浴下聲振1.5 min，加入適量4%PVA水溶液；相同條件下再次聲振后，置于磁力攪拌器攪拌4 h，雙蒸水多次離心洗滌，制得載DTX及ZnPc的非靶向PLGA納米。將載DTX及ZnPc的非靶向PLGA納米重懸于適量MES緩沖液(0.1 mol/L,pH=5.5)，分別加入適量耦聯(lián)活化劑EDC和NHS(PLGA∶EDC摩爾比為1∶10；EDC∶NHS質(zhì)量比為1∶3)，冰浴下振蕩2 h；離心洗滌后，重懸于適量MES緩沖液(0.1 mol/L,pH=8)中，再加入適量FITC-RGDfk(RGDfk∶PLGA摩爾比為1∶1)，冰浴下振蕩過夜；離心洗滌數(shù)次，制得靶向PLGA@ZnPc@DTX，4℃冰箱保存。

1.3 PLGA@ZnPc@DTX一般特征評(píng)價(jià)及包封率測(cè)定 觀察PLGA@ZnPc@DTX探針形態(tài)，并檢測(cè)其粒徑、表面電位。采用紫外分光光度法及高效液相色譜法(HPLC)分別檢測(cè)PLGA@ZnPc@DTX中ZnPc及DTX的包封率和載藥量，檢測(cè)波長分別為670 nm、275 nm。取適量已知濃度PLGA@ZnPc@DTX懸液，離心洗滌后，所得沉淀以DMSO∶三氯甲烷為1∶1的溶液溶解破乳，采用紫外分光光度法及HPLC法檢測(cè)ZnPc及DTX含量。包封率(%)=檢測(cè)量/總投放量×100%，載藥量(μg/mg)=檢測(cè)量/載藥納米?？傎|(zhì)量。

1.4 PLGA@ZnPc@DTX體外釋放實(shí)驗(yàn) 取2個(gè)透析袋(相對(duì)分子質(zhì)量14 000)，分別標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，以去離子水浸泡處理后待用；將PLGA@ZnPc@DTX加入2 ml PBS(pH 7.4)溶液重懸，吸取2份適量納米粒分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組透析袋中，扎緊袋口，以含0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)的50 ml PBS(pH 7.4)溶液為釋放介質(zhì)，37℃水浴恒溫?cái)嚢?100 r/min)；在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h)取樣2 ml，同時(shí)補(bǔ)加同體積釋放介質(zhì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組于2.0 h時(shí)以0.5 W功率激光照射5 min；對(duì)照組不進(jìn)行激光照射。將所取樣品用HPLC法測(cè)定釋放介質(zhì)中DTX含量，計(jì)算累計(jì)釋放率，繪制體外釋放曲線。

1.5 體外PAI 將PLGA@ZnPc@DTX稀釋至適合濃度，加入3%瓊脂糖凝膠模型中，采用光聲成像儀680～960 nm波長激光觸發(fā)納米粒，并同步采集光聲圖像。制備6組不同ZnPc含量(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg)納米粒，稀釋至相同濃度，各取適量分置于凝膠模型中，以激光觸發(fā)6組納米粒，使用PAI儀同步采集圖像，并記錄光聲信號(hào)值。以不含ZnPc納米粒作對(duì)照。

1.6 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 靶向PLGA@ZnPc@DTX表面FITC-RGDfk連接率及體外尋靶能力 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC-RGDfk與PLGA@ZnPc@DTX結(jié)合率。取適量對(duì)數(shù)生長期MBA-MD-231細(xì)胞接種于數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞全部貼壁并生長到適量密度，分別加入經(jīng)DiI處理的靶向與非靶向PLGA@ZnPc@DTX孵育2 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入適量熒光染料DAPI，孵育10 min，PBS沖洗數(shù)次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取適量對(duì)數(shù)生長期的MBA-MD-231細(xì)胞，接種于6孔板中，以37℃、5%CO2條件培養(yǎng)孵育24 h，并分為6組：A組，加入不含ZnPc及DTX的空白納米粒；B組，加入含DTX、不含ZnPc的納米粒；C組，加入含ZnPc及DTX的非靶向納米粒；D組，加入含ZnPc及DTX的靶向納米粒；E組，加入含ZnPc及DTX的非靶向納米粒，并以激光輻照；F組，加入含ZnPc及DTX的靶向納米粒，并以激光輻照；之后繼續(xù)孵育12 h，重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA@ZnPc@DTX基本特性 成功制備PLGA@ZnPc@DTX納米粒，光鏡下呈形態(tài)大小均勻的球形粒子；透射電鏡下呈表面規(guī)整球形粒子(圖1A)；平均粒徑為(266.00±65.85)nm，表面電位為(-29.20±6.27)mV(圖1B、1C)。DTX的包封率、載藥量分別為(88.00±0.32)%、(34.92±0.02)μg/mg，ZnPc的包封率、載藥量分別為(97.25±0.22)%、(30.87±0.11)μg/mg。

2.2 體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PLGA@ZnPc@DTX在釋放介質(zhì)中24.0 h后，釋放率約50%，48.0 h后釋放率約68%，72.0 h后釋放率約77%。采用激光輻照，實(shí)驗(yàn)組呈緩慢釋放趨勢(shì)(圖2)。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)PLGA@ZnPc@DTX多烯紫杉醇累積釋放率

2.3 體外PAI結(jié)果 光聲值波峰出現(xiàn)于700 nm時(shí)，故選定700 nm為激光激發(fā)波長。不同ZnPc含量納米粒光聲信號(hào)隨ZnPc含量增加而呈明顯梯度增強(qiáng)(圖3)，呈近似線性關(guān)系。

2.4 靶向PLGA@ZnPc@DTX靶向連接率及及體外尋靶能力 共聚焦顯微鏡下靶向PLGA@ZnPc@DTX經(jīng)DiI染色外殼呈紅色熒光(圖4A)，F(xiàn)ITC-RGDfk呈綠色熒光(圖4B)，融合圖像中，兩者疊加后呈黃色熒光(圖4C)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得PLGA@ZnPc@DTX與FITC-RGDfk結(jié)合率為89.19%。

經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)光，靶向納米粒(圖4D)細(xì)胞周圍見大量黃色熒光的靶向納米粒，而非靶向納米粒(圖4E)周圍則見極少紅色熒光。

2.5 細(xì)胞凋亡率 A、B、C、D、E、F組MBA-MD-231細(xì)胞凋亡率分別為(7.06±2.64)%、(19.31±4.83)%、(17.41±1.78)%、(26.99±5.53)%、(41.54±3.27)%、(62.87±5.95)%，5組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.22，P<0.05)；其中A組與B組、F組，B組與F組，C組與D組、E組、F組，D組與F組，E組與F組細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

目前PAI研究多集中于檢測(cè)肉眼可見的實(shí)體腫瘤[2，12-13]，其敏感度由內(nèi)源性對(duì)比決定，且不能準(zhǔn)確區(qū)分正常與異常組織。除少數(shù)腫瘤細(xì)胞(如黑素瘤細(xì)胞)外，多數(shù)腫瘤細(xì)胞無內(nèi)源性吸收對(duì)比[14-19]，故選擇可增強(qiáng)光學(xué)吸收、放大光聲信號(hào)生成效率的外源性造影劑對(duì)提高PAI敏感度至關(guān)重要[20]。DTX雖是應(yīng)用廣泛的抗癌藥物，但其水溶性差、毒副作用多，且常用制劑藥物的半衰期較短；同時(shí)，相較于游離DTX分子由被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、再通過P-糖蛋白泵運(yùn)出細(xì)胞的過程，制備成納米粒的DTX系通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,并可避免P-糖蛋白泵的影響,使腫瘤細(xì)胞內(nèi)有更高藥物濃度[21]。研究[22]表明，納米顆?？商岣呖拱┧幬锆熜У脑蛟谟趯?shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect， EPR)所致被動(dòng)定向能力可促進(jìn)局部藥物吸收，并增加藥物的生物利用度。

本研究以PLGA為基材，包裹ZnPc及DTX，采用雙乳化法制備出一種擁有良好光聲顯影能力的外源性光聲造影劑，并利用碳二亞胺法連接腫瘤靶向肽RGD，使其成為具備診療一體化能力的多功能納米探針；其DTX及ZnPc包封率較高，克服了DTX水溶性差、毒副作用大及藥物半衰期短的缺點(diǎn)；所制備納米粒在700 nm處具有明顯光聲信號(hào)，具備成為光聲造影劑的條件。體外乳腺癌細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在激光輻照下，連接RGD的靶向PLGA@ZnPc@DTX能夠顯著提高對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷力，為后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)PAI并聯(lián)合腫瘤治療提供了前提條件。另外，ZnPc是第二代光敏劑酞菁衍生物的代表，常用于另一新興的無創(chuàng)性癌癥治療方法——光動(dòng)力療法(photodynamic therapy， PDT)[23]。今后將進(jìn)一步研究其在光動(dòng)力學(xué)療法中的性能，并嘗試制備結(jié)合光聲顯像、靶向化療，以及光動(dòng)力學(xué)治療的新型納米探針。

圖3 不同濃度納米粒光聲信號(hào)圖 A～F.ZnPc含量分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg的納米粒PAI圖像； G.不含ZnPc的納米粒PAI圖像； H.不同波長激光觸發(fā)納米粒時(shí)的光聲值

圖4PLGA@ZnPc@DTX表面RGD連接情況及體外尋靶能力 A.經(jīng)DiI染色納米粒呈紅色熒光(×800)； B.經(jīng)FITC染色RGDfk呈綠色熒光(×800)； C.圖A與圖B的融合圖像疊加后呈黃色熒光(×800)； D.靶向納米粒(×400)； E.非靶向納米粒(×400)

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