黃自坤，李 雪，羅 清

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因尚未闡明的慢性全身性炎癥性的自身免疫性疾病，其主要特點(diǎn)是不可逆的關(guān)節(jié)炎癥和損傷[1]。RA病因復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境、感染和體內(nèi)激素水平等因素有關(guān)[2]。骨關(guān)節(jié)炎( osteoarthritis，OA) 是一種中老年人常見(jiàn)的慢性、漸進(jìn)性和退行性關(guān)節(jié)疾病，病理變化常見(jiàn)軟骨的降解、關(guān)節(jié)邊緣骨贅的形成、關(guān)節(jié)囊的改變和滑膜炎癥。雖然RA致病機(jī)制還不明確，但已有研究[3]表明單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等參與RA的發(fā)生和發(fā)展。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌大量的炎性細(xì)胞因子來(lái)維持RA患者的炎性環(huán)境以及招募大量的免疫細(xì)胞遷移至關(guān)節(jié)炎，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不可逆的損傷。巨噬細(xì)胞作為全血代謝、造血功能、血管生成、細(xì)胞凋亡、腫瘤和繁殖過(guò)程的參與者，在OA的發(fā)病中也起著非常重要的作用[4]。研究[5]表明在眾多的炎癥細(xì)胞中巨噬細(xì)胞與OA的炎癥過(guò)程緊密相連。巨噬細(xì)胞極化是靜息巨噬細(xì)胞在不同環(huán)境下分化成不同表型：M1(促炎型)和M2(抑炎型)，而 M1與M2在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)應(yīng)答[6-7]。該研究通過(guò)檢測(cè)RA患者和OA患者外周血單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞表面極化指標(biāo)(M1：CD206、CD163；M2：CD64、CD40、CD86、HLA-DR)的表達(dá)，包括平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)和百分率，分析其與疾病活動(dòng)度、炎癥程度和自身抗體的關(guān)系，探討單核巨噬細(xì)胞極化在RA發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年6月～2017年9月于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的28例RA患者作為RA組，其中男5例，女23例，年齡25～80(55.18±14.85)歲，臨床診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1987年的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，都有關(guān)節(jié)腔積液，并排除嚴(yán)重糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病、肝腎疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。選取同期于風(fēng)濕免疫科就診的OA患者20例作為對(duì)照組，男3例，女18例，年齡44～82(58.20±10.22)歲，臨床診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1986年的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中6例有關(guān)節(jié)腔積液。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳細(xì)收集RA患者臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，并計(jì)算其RA疾病活動(dòng)性評(píng)分(disease activity score 28, DAS28)[10]。所有的RA患者在采集標(biāo)本前使用了抗風(fēng)濕病藥物的治療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑和儀器流式細(xì)胞抗體藻紅蛋白標(biāo)記的CD163抗體(phycoerythrin-CD163, PE-CD163)、PE標(biāo)記的CD206抗體(PE-CD206)、PE標(biāo)記的CD86抗體(PE-CD86)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD40抗體(fluorescein isothiocyanate-CD40，F(xiàn)ITC-CD40)、FITC標(biāo)記的CD64抗體(FITC-CD64)、FITC標(biāo)記的HLA-DR抗體(FITC-HLA-DR)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，藻紅蛋白-得克薩斯紅標(biāo)記的CD14抗體(phycoerythrin-texas red，ECD-CD14)及相應(yīng)的同型對(duì)照PE-IgGl和FITC-IgG1均購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統(tǒng)。

1.3單個(gè)核細(xì)胞提取采集受試者清晨空腹EDTA抗凝外周血5 ml和關(guān)節(jié)腔積液10 ml，6 h內(nèi)送檢。采用 Ficoll-Paque 分離液 (美國(guó)Sigma公司)提取RA患者及對(duì)照者的單個(gè)核細(xì)胞。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的細(xì)胞加入4支試管中，按以下組合加入單克隆抗體各10 μl：ECD-CD14、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD14、PE-CD163、FITC-CD64; ECD-CD14、PE-CD206、FITC-CD40; ECD-CD14、PE-CD86、FITC-HLA-DR，4 ℃避光孵育30 min，室溫1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌2次，用500 μl生理鹽水重懸上機(jī)檢測(cè)。Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，使用CXP分析軟件分析細(xì)胞CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/HLA-DR的表達(dá)。

1.5RA的其他指標(biāo)檢測(cè)方法類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)采用速率散色比濁法(美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè)；抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶聯(lián)免疫吸附法(上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司)檢測(cè)；紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)采用動(dòng)態(tài)血沉儀法(北京普利生公司)檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩變量為正態(tài)分布數(shù)據(jù)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，否則采用Spearman 相關(guān)分析。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RA組及OA組外周血單核細(xì)胞極化指標(biāo)的表達(dá)水平采用流式細(xì)胞術(shù)分析RA組和OA組外周血單核細(xì)胞(CD14+)上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)表1，RA組外周血單核細(xì)胞CD163、CD206、CD40、CD64和HLA-DR表達(dá)的MFI，顯著高于OA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；外周血單核細(xì)胞上的CD86表達(dá)的MFI在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而RA組外周血單核細(xì)胞CD163、CD206、CD40、CD80、CD64和HLA-DR表達(dá)百分率與OA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 RA組及OA組單核細(xì)胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達(dá)

2.2RA組外周血單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)的表達(dá)水平采用流式細(xì)胞術(shù)分析RA組外周血單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)表2，RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD206、CD40、CD86和HLA-DR表達(dá)的MFI顯著高于RA組的外周血單核細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CD163和CD64表達(dá)的MFI在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD206、CD40 和CD64表達(dá)百分率顯著高于外周血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)百分率低于外周血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD86和HLA-DR表達(dá)百分率與外周血比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3RA組及OA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)的表達(dá)水平采用流式細(xì)胞術(shù)分析RA組及OA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)表3，RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達(dá)的MFI與OA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞HLA-DR表達(dá)百分率顯著高于OA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)百分率低于OA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD206、CD40、CD64和CD86表達(dá)百分率與OA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163和HLA-DR表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系本文進(jìn)一步分析RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163、HLA-DR表達(dá)與DAS28、ESR、RF、ACPA的相關(guān)性顯示：RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163表達(dá)百分率與ACPA的含量呈正相關(guān)性，而與DAS28、ESR、RF之間無(wú)相關(guān)性；RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上HLA-DR表達(dá)百分率與DAS28、ESR、RF、ACPA之間無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖1。

表2 RA組單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達(dá)

表3 RA組及OA對(duì)照組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達(dá)

圖1 RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞上CD163表達(dá)百分率與ACPA含量的關(guān)系

3 討論

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在RA患者的炎性環(huán)境的維持以及不可逆的關(guān)節(jié)損傷中發(fā)揮著重要的作用，而巨噬細(xì)胞極化在這個(gè)過(guò)程中作用還不是很明確，尤其是外周血中單核細(xì)胞上極化指標(biāo)的表達(dá)及其作用了解甚少。Zhu et al[11]研究發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)的巨噬細(xì)胞是M1和M2混合型，但以M1為主。Soler Palacios et al[12]研究發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)的巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1相關(guān)的基因以及M1相關(guān)的表型，說(shuō)明其以M1為主。Highton et al[13]研究發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血單核細(xì)胞表達(dá)HLA-DR和CD64等M1極化指標(biāo)。這些研究表明RA患者中單核巨噬細(xì)胞的極化表型還存在爭(zhēng)議。OA 一般常見(jiàn)于老年人，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)樘卣鳎瑹o(wú)菌性、慢性、進(jìn)行性、侵犯關(guān)節(jié)，特別是負(fù)重關(guān)節(jié)的疾病，一般認(rèn)為是關(guān)節(jié)老化的現(xiàn)象。OA 的發(fā)病原因不明，目前越來(lái)越多的證據(jù)表明單核巨噬細(xì)胞與OA的炎癥過(guò)程密切相關(guān)[4-5]。而單核巨噬細(xì)胞參與的炎癥過(guò)程在RA和OA中的具體作用以及機(jī)制是否相同還不是很明了，尤其是單核巨噬細(xì)胞極化所發(fā)揮的作用。因此，為了深入了解單核巨噬細(xì)胞極化在RA中的作用，本研究對(duì)RA患者和OA患者外周血單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞的極化指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明RA患者外周血單核細(xì)胞高表達(dá)M1型和M2型極化指標(biāo)，呈現(xiàn)M1和M2混合型，說(shuō)明RA患者外周血單核細(xì)胞被活化、處于極化調(diào)控的動(dòng)態(tài)平衡，如果M1型巨噬細(xì)胞不斷增多, 則炎癥加劇，病情進(jìn)展[14]；此外，RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1極化指標(biāo)、低表達(dá)M2極化指標(biāo)，呈現(xiàn)M1型，關(guān)節(jié)有明顯的炎癥。不同研究其結(jié)果不一致可能原因是不同RA患者異質(zhì)性較大，其病程、用藥情況、自身抗體的狀況、年齡和性別都有所差異，且其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。

本研究還分析了RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)表達(dá)與炎癥指標(biāo)、自身抗體和疾病活動(dòng)性的相關(guān)性。在RA患者中，關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞CD163的表達(dá)水平與自身抗體ACPA密切相關(guān)。而近期研究[11]顯示ACPA抗體可影響巨噬細(xì)胞的極化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1轉(zhuǎn)化。

此外，需要指出的是,本文尚存在一些不足：① OA患者的關(guān)節(jié)腔積液研究樣本不夠多；② 沒(méi)有檢測(cè)未用藥的新發(fā)RA患者，因此本文無(wú)法了解在沒(méi)有藥物干擾情況下,極化在RA中的作用。本研究在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并檢測(cè)未用藥新發(fā)RA 患者極化指標(biāo)表達(dá)情況,使研究結(jié)果更具可靠性。

綜上所述, RA 患者外周血單核細(xì)胞呈現(xiàn)M1和M2混合型，關(guān)節(jié)腔積液巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1型，且與ACPA的含量相關(guān)。深入研究單核巨噬細(xì)胞的極化表型對(duì)RA患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，可為闡明 RA 患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及臨床免疫治療提供新思路。

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