張金玲，張 濤，國建飛，鄭 麗，楊群福，崔福生，張宇新

顱腦損傷是一種常見病、多發(fā)病，其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一，其中顱腦創(chuàng)傷后認(rèn)知功能障礙對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生重要的影響，且認(rèn)知功能障礙是顱腦損傷后最持久、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。近年來，大量研究[2]顯示顱腦損傷后出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而出現(xiàn)認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶功能障礙。目前，國內(nèi)外研究對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及認(rèn)知功能障礙的確切機(jī)制尚無完全揭示。因此，該研究利用Marmarou方法構(gòu)建閉合性顱腦損傷模型，采用實時定量熒光PCR、免疫組織化學(xué)、原位末端標(biāo)記技術(shù)法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)及Y型迷宮實驗對大鼠顱腦創(chuàng)傷后Fas表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，以及應(yīng)用塞來昔布藥物的治療作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑塞來昔布購自美國輝瑞制藥有限公司；兔抗人Fas多克隆抗體、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid protease-8，Caspase-8)多克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；PCR試劑盒、細(xì)胞和組織裂解液均購自美國Invitrogen公司；PV-6001/6002二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Y型三等臂式迷宮刺激器由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組 SPF級健康雄性Wistar大鼠96只，體質(zhì)量280～300 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境，Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組：對照組、假手術(shù)組、模型組、藥物組，每組24只。

1.2.2構(gòu)建大鼠顱腦創(chuàng)傷模型 參照Marmarou et al[3]方法構(gòu)建大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型，假手術(shù)組僅切開頭皮縫合，不予以打擊，分籠飼養(yǎng)，于術(shù)后2～8 h恢復(fù)飲食；對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.2.3給藥方法 藥物組于模型制作成功后即刻給予塞來昔布藥物(250 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，隨后每隔6 h給藥1次，直至各時相點處死；對照組、假手術(shù)組、模型組在相同時間內(nèi)給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.4腦組織取材 術(shù)后72 h選取SD大鼠，乙醚吸入深度麻醉，快速開胸暴露心臟，灌注生理鹽水，隨后灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h以上。取出腦組織標(biāo)本，以損傷灶為中心，切取厚約4 mm左右的組織標(biāo)本，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度為4.5 μm，60 ℃烤箱烘烤4 h后，室溫下保存?zhèn)溆?。另取部分腦組織放置于凍存管中，立即投入液氮速凍，以備實時定量熒光PCR檢測使用。

1.2.5實時定量熒光PCR法檢測Fas、Caspase-8的mRNA表達(dá) 取出腦組織，滴加400 μl ERSR裂解液，參照TRIzol說明書提取總RNA，檢測RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)：Fas引物序列(414 bp)：上游5′-GAATGCAAGGGACTGATAGC-3′；下游5′-TGGTTCGTGTGCAAGGCTC-3′；caspase-8引物序列(109 bp)：上游：5′-CGAACGATCAAGCACAGAGAGA-3′；下游：5′-CTGGCGAGTCCCACATGTC-3′；β-actin引物序列(277 bp)：上游5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′；下游5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。實驗結(jié)果采用相對定量的方法進(jìn)行分析。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測腦組織Fas、Caspase-8表達(dá) 常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育，滅活內(nèi)源性過氧物酶，枸櫞酸鹽溶液100 ℃沸騰，組織抗原熱修復(fù)；血清封閉液室溫孵育；滴加兔抗人Fas(1 ∶200)、兔抗人Caspase-8多克隆抗體，于4 ℃下孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育；DAB顯色；蘇木精復(fù)染，流水沖洗反藍(lán)；0.1%鹽酸酒精分化；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并采集照片；采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析圖片染色結(jié)果，依據(jù)染色分?jǐn)?shù)(染色強(qiáng)度)評分評定結(jié)果。

1.2.7TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況 常規(guī)脫蠟脫水；3% H2O2室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；Proteinase K工作液孵育消化15 min；標(biāo)記緩沖液20 μl，保持切片濕潤；封閉液50 μl，室溫孵育30 min；50 μl生物素化抗地高辛抗體，37 ℃孵育30 min；50 μl鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，甘油封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.8迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知功能 嚴(yán)格按照Y型迷宮刺激器說明要求操作，將大鼠置于迷宮中，10 s內(nèi)大鼠1次成功直接逃至安全區(qū)域記為行為正確，否則記為行為錯誤。給予10次電刺激后有9次做出正確行為記為“學(xué)會”，記錄“學(xué)會”大鼠所需訓(xùn)練的次數(shù)(記憶獲得能力)。休息24 h后再行20次上述測試，正確行為次數(shù)記錄為記憶成績。

2 結(jié)果

2.1各組Fas、Caspase-8的mRNA表達(dá)各組Fas和Caspase-8的mRNA表達(dá)量，見表1。各組Fas和Caspase-8表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.64、36.30，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8的mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組、假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組與創(chuàng)傷組比較Fas和Caspase-8的mRNA表達(dá)量有所降低(P<0.05)，但仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)；假手術(shù)組與對照組之間兩者的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實時熒光定量PCR檢測腦組織Fas、Caspase-8的mRNA表達(dá)

圖1 免疫組織化學(xué)染色法觀察腦組織Fas表達(dá) ×400

圖2 免疫組織化學(xué)染色法觀察腦組織Caspase-8表達(dá) ×400

圖3 TUNEL染色觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 ×400

2.2各組腦組織中Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)Fas、Caspase-8陽性表達(dá)定位于腦組織神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜，陽性反應(yīng)呈棕黃色染色，假手術(shù)組腦組織偶見陽性細(xì)胞，染色淺，模型組可見大量陽性細(xì)胞，胞質(zhì)著色棕黃，染色深，藥物組可見少量陽性細(xì)胞，著色程度較淺，見圖1、2。經(jīng)Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)半定量分析得出光密度值，見表2。各組Fas和Caspase-8表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=112.26、84.55，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8表達(dá)量均高于對照組、假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組與模型組比較Fas和Caspase-8表達(dá)量均減少(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和對照組(P<0.05)；假手術(shù)組與對照組之間兩者的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 免疫組織化學(xué)法檢測腦組織Fas、Caspase-8的表達(dá)

2.3各組細(xì)胞凋亡情況TUNEL染色陽性凋亡細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，對照組和假手術(shù)組腦組織偶見凋亡細(xì)胞，模型組腦組織可見大量凋亡細(xì)胞，藥物組可見少量凋亡細(xì)胞。對照組、假手術(shù)組、模型組、藥物組的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為(4.32±0.25)、(6.21±0.46)、(28.60±1.23)、(11.91±0.60)。各組之間凋亡細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.57，P<0.001)，模型組較對照組、假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；藥物組較模型組凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和對照組(P<0.05)；假手術(shù)組與對照組之間兩者的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4各組大鼠認(rèn)知功能情況各組大鼠記憶功能比較，見表3。各組大鼠之間記憶獲得次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.28，P=0.064)；各組大鼠之間記憶成績次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.60，P<0.001)，模型組較對照組、假手術(shù)組大鼠記憶成績次數(shù)明顯減少(P<0.05)，而藥物組較模型組大鼠記憶成績次數(shù)明顯增加(P<0.05)，但仍低于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)；對照組與假手術(shù)組之間記憶成績次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組大鼠記憶功能的比較

3 討論

顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害可加重腦損傷程度，是患者顱腦損傷后致殘和死亡的主要原因。大量研究[4]均證實細(xì)胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害的病理過程，研究探索阻抑顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的腦保護(hù)策略是近年研究的熱點話題。環(huán)氧合酶-2是重要的炎癥介質(zhì)，是介導(dǎo)花生四烯酸代謝、血栓素A2、前列腺素生物合成過程中重要的限速酶，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性在繼發(fā)性腦損傷神經(jīng)元凋亡過程發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究通過探討塞來昔布對顱腦創(chuàng)傷后Fas表達(dá)及認(rèn)知功能的影響，分析其對顱腦創(chuàng)傷后的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為塞來昔布臨床應(yīng)用于顱腦創(chuàng)傷治療提供可靠的實驗和理論依據(jù)。

目前，顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡已成為近幾年來關(guān)注的熱點，大量研究[7]均表明，顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。通過調(diào)控凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)阻抑神經(jīng)細(xì)胞凋亡以治療顱腦創(chuàng)傷正成為目前神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的研究熱點之一。顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個主動的細(xì)胞死亡過程，是由抗凋亡基因和促凋亡基因參與調(diào)控的。Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體，屬于神經(jīng)生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族成員，研究表明Fas在顱腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，顱腦損傷后神經(jīng)元凋亡發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵性因素，F(xiàn)as與Fas-L結(jié)合后，通過介導(dǎo)Caspase激活的外源性激活途徑，再經(jīng)過Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8-9]。Beer et al[10]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠顱腦損傷灶的腦皮質(zhì)內(nèi)Fas、FasL高表達(dá)，并參與顱腦損傷后的凋亡及炎癥反應(yīng)。Rosenbaum et al[11]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠局灶性顱腦損傷區(qū)神經(jīng)元Fas、FasL表達(dá)增加，表明Fas介導(dǎo)的凋亡過程參與了顱腦損傷的病理過程。劉清軍 等[12]發(fā)現(xiàn)在顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞過度表達(dá)Fas mRNA，并且該區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，推測Fas的過度表達(dá)可能是腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因。

本研究首先參照Marmarou方法構(gòu)建大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型，采用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法檢測Fas、Caspase-8表達(dá)，TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，Y型迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織Fas和Caspase-8的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，大鼠記憶成績次數(shù)明顯減少。而塞來昔布藥物可使大鼠顱腦創(chuàng)傷后Fas和Caspase-8表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，大鼠記憶成績次數(shù)增加。考慮顱腦損傷后其可能的作用機(jī)制為Fas與其配體FasL結(jié)合，通過胞質(zhì)內(nèi)Fas相關(guān)死亡域蛋白，進(jìn)一步和Caspase-8酶原發(fā)生相互作用，激活Caspase-8酶原，再經(jīng)過Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并造成不同程度的神經(jīng)功能障礙，可表現(xiàn)為認(rèn)知功能以及智力的減退。而環(huán)氧合酶-2特異性抑制劑塞來昔布可通過抑制上述Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑信號通路，抑制Fas表達(dá)，進(jìn)一步抑制其下游Caspase-8表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善認(rèn)知功能和空間學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮顱腦保護(hù)作用。王金光 等[13]研究發(fā)現(xiàn)Fas參與了脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，F(xiàn)as和Caspase-3的表達(dá)變化有一定的相關(guān)性。趙景霞 等[14]研究發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白表達(dá)增加并出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，美洛寧能夠減少腦創(chuàng)傷后Fas蛋白表達(dá)，并減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

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