李夢華，王國義，張曉旭,3，張 磊，程 湛，馬麗艷，李景明,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京 101149；3.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理處，新疆 烏魯木齊 830091）

炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）為曲霉屬黑色曲霉菌，主要侵染葡萄、咖啡、可可和花生等食品[1]，當(dāng)食品受到炭黑曲霉污染后會出現(xiàn)腐敗變質(zhì)、營養(yǎng)散失等現(xiàn)象，甚至還會產(chǎn)生有毒的代謝物質(zhì)——赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）[2]。OTA對人體的危害僅次于黃曲霉毒素，它主要侵害人和動物的腎臟和肝臟[3]，具有致畸[4]、致癌[5]、致突變[6]等作用，還具有免疫系統(tǒng)毒性[7]、神經(jīng)毒性[8]，被國際癌癥研究機構(gòu)定為2B級致癌物[9]。食品中有害微生物及真菌毒素的檢測，通常使用微生物培養(yǎng)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀甚至分子學(xué)手段[10-12]，這些方法不僅前處理復(fù)雜，檢測耗時，而且所需設(shè)備投資大。因此，迫切需要建立一種快速、有效且較少損壞檢測基質(zhì)原有狀態(tài)的方法，以便對食品和環(huán)境受微生物污染情況進行評價。

微生物在其代謝過程中通常會產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)（microbial volatile organic compounds，MVOCs），它們是由微生物以乙酸鹽、氨基酸、脂肪酸、酮酸和糖類等多種物質(zhì)為底物，通過初級代謝和次級代謝過程形成的一類天然有機組分[13]。研究發(fā)現(xiàn)已有近1 000 種MVOCs被確定，可分為酮類、醇類、醛類、酯類、萜烯類、烴類和芳香類等[14-15]。這些物質(zhì)往往具有較低的閾值，可以被人類的嗅覺所感知，并且在微生物菌落可見之前便可被檢測到[16-17]，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

不同種微生物產(chǎn)生的MVOCs具有種屬特異性，因此MVOCs不僅可作為種屬鑒別的標(biāo)志物[18-19]，在食品受微生物污染程度判斷方面更具有應(yīng)用潛力[20]。研究表明，3-辛酮、1-辛烯-3-醇等C8類物質(zhì)多具有蘑菇、霉土氣味，可作為食品腐敗的標(biāo)志性物質(zhì)[21-22]。此外，MVOCs還與微生物毒素的產(chǎn)生有一定相關(guān)性[22]，可用于探究微生物生長過程中特定生命活動（例如合成、積累真菌毒素等），從側(cè)面闡明微生物代謝活動規(guī)律。綜上可知，通過測定MVOCs的種類及含量，可為早期預(yù)測、預(yù)警食品腐敗或毒素污染情況[23-24]，盡早采取措施進行控制提供一種新的思路和途徑。

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法[25]是近年來揮發(fā)性成分分析中較為經(jīng)典的方法，具有簡便操作、無需前處理及溶劑萃取、所需樣品量少等優(yōu)點，在食品、環(huán)境、天然產(chǎn)物、醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床化學(xué)、毒理和法醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究中使用廣泛[26-27]，但針對真菌MVOCs的研究應(yīng)用鮮有報道。本實驗擬采用SPME-GC-MS法分析炭黑曲霉MVOCs，通過對萃取頭涂層材料、萃取溫度和萃取時間進行優(yōu)化，以期得到基于SPME-GC-MS的炭黑曲霉MVOCs最佳分析鑒定方法，并對該方法進行評價，確立用于檢測炭黑曲霉MVOCs的較好條件，為以后食品中霉菌污染情況的快速無損檢測提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2 株炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius），編號分別為CCTCC AF2011004（AF菌）和CCTCC AF2015027（SD菌）獲得于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。2 株菌篩選來源不同，其中AF菌從葡萄果實中分離得到[28]，SD菌從葡萄干產(chǎn)品中分離得到[29]。

查氏酵母膏瓊脂（CYA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Milli Q water（電阻率≥18.2 Ω） 美國Millipore公司；正構(gòu)烷烴C8～C20美國Supelco公司；揮發(fā)性組分標(biāo)準(zhǔn)樣品（3-辛酮、1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、棕櫚酸甲酯、α-柏木烯、羅漢伯烯、β-法尼烯、β-花柏烯、花側(cè)柏烯、反式-橙花叔醇、苯乙烯）、內(nèi)標(biāo)C14美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；XSZ-3G型顯微鏡 重慶國電儀器有限公司；DL-CJ-2ND型超凈工作臺 武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；DHP-9162型培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；固相微萃取手柄、固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、85 μm PA）、加熱磁力攪拌器 美國Supelco公司；SPME樣品瓶（30 mL） 中國安普公司；6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀、DB-5氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

菌株活化：從甘油管中吸取100 μL孢子懸液均勻涂布于CYA培養(yǎng)基平板上，25 ℃避光培養(yǎng)5 d，用接種環(huán)蘸取少量孢子在相同的培養(yǎng)條件下進行第二次活化，以獲得活力較好的菌株。待培養(yǎng)基表面布滿孢子后，加入10 mL 0.05%吐溫80無菌溶液輕輕刮取，再用8 層紗布過濾掉菌絲，制得孢子懸液。顯微鏡計數(shù)，再用吐溫80溶液稀釋至孢子濃度為106個/mL。

樣品培養(yǎng)：吸取10 mL配制好的CYA培養(yǎng)基到30 mL小瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min。滅菌后鋪至斜面，待培養(yǎng)基凝固后，接種100 μL孢子懸液至斜面，搖勻，25 ℃避光培養(yǎng)5 d。

1.3.2 SPME分離

先將首次使用的固相微萃取頭分別在GC的進樣口于250 ℃老化至無雜峰。將10 μL 5 mg/L C14內(nèi)標(biāo)添加到培養(yǎng)炭黑曲霉的樣品瓶內(nèi)，放入一定溫度的恒溫水浴環(huán)境中。插入SPME裝置到樣品瓶中，推出萃取頭，保持高度一致，頂空吸附一段時間，再將其從樣品瓶中拔出，插入GC-MS進樣口，推出萃取頭于240 ℃解吸附7 min。

1.3.3 GC-MS分析

GC條件：參考Jeleń等[30]檢測方法，色譜柱為極性色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度240 ℃，氣相色譜升溫程序：35 ℃保持1 min，以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃，再以20 ℃/min升溫至280 ℃。載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，不分流進樣。

MS條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃；掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍為40～440 u。

1.3.4 定性定量方法

定性：鑒定結(jié)果由NIST08譜庫檢索保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品共同確定。檢索譜庫結(jié)果按相似度大于800（最大值1 000）的原則作為鑒定結(jié)果。

定量：有標(biāo)樣的物質(zhì)用線性回歸方程進行定量，無標(biāo)樣的揮發(fā)性成分利用結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量[20,31]。

1.3.5 方法可行性評價

線性范圍：對有標(biāo)樣的組分進行線性范圍測定。分別配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述實驗條件下找出它們的線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每條標(biāo)曲由7 個濃度點組成，每個濃度點進行3 次方法學(xué)平行實驗。

檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantify，LOQ）：符合信噪比為10的加標(biāo)樣品所對應(yīng)的濃度為LOQ；符合信噪比為3的加標(biāo)樣品對應(yīng)的濃度為LOD。

加標(biāo)回收實驗及精密度：加標(biāo)實驗要求在1 d內(nèi)完成。將2 個水平的溶劑混標(biāo)添加到空白培養(yǎng)基中，靜置2 h以待標(biāo)樣浸入培養(yǎng)基中，每個水平重復(fù)6 次。當(dāng)回收率在70%～120%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard division，RSD）低于20%時，可認(rèn)為回收率符合要求；計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為精密度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)理分析統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P小于0.05為具有顯著性差異，認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。運用Excel軟件進行圖形繪制及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取頭的選擇結(jié)果

不同材質(zhì)的萃取頭對不同化合物的萃取效率不同，本實驗選用了50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、85 μm PA四種萃取頭在萃取溫度45 ℃、萃取時間60 min的條件下，分別考察了其對炭黑曲霉MVOCs的萃取分離效果，得到的GC-MS總離子色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，DVB/CAR/PDMS萃取頭能萃取到酯類、醇類、酮類、醛類物質(zhì)和半萜烯類物質(zhì)。盡管CAR/PDMS也萃取到了以上4 類化合物，但是萃取到的半萜烯類物質(zhì)種類少于DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭，且烴類物質(zhì)萃取到的種類與響應(yīng)也不如DVB/CAR/PDMS高。而PDMS和PA萃取頭與DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭相比，雖能萃取到更多的烴類物質(zhì)，且響應(yīng)水平高，但未能萃取到酯類物質(zhì)，而且萃取到的半萜烯類物質(zhì)種類較DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭少、響應(yīng)水平低。這與Jeleń[32]和Sun Dongdi[33]等的結(jié)果一致。本方法擬捕獲較多種類物質(zhì)以及達到較高響應(yīng)度為原則，因此，最終選擇DVB/CAR/PDMS復(fù)合涂層萃取頭作為炭黑曲霉MVOCs的萃取涂層。

圖1 4 種萃取頭MVOCs總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of MVOCs extracted with four different SPME fibers

2.2 SPME溫度的選擇結(jié)果

溫度對SPME效果有雙重效應(yīng)。溫度升高，一方面可加速樣品中MVOCs的運動，有利于SPME；另一方面也會增加萃取頭的解吸速度，從而降低萃取效率。本實驗參考Jeleń等[21]的研究，用DVB/CAR/PDM萃取頭在45、60 ℃和75 ℃條件下進行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示，隨著提取溫度升高，各類物質(zhì)的相對含量（與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值）總和也隨之升高。但當(dāng)溫度升高至75 ℃時，培養(yǎng)基融化，無法維持原有形態(tài)，影響萃取效果。因此，最終選擇60 ℃作為炭黑曲霉MVOCs的最佳萃取溫度。

2.3 萃取時間的選擇結(jié)果

圖2 不同萃取條件下酯、醇酮醛、半萜烯和烴類物質(zhì)相對含量和總峰面積比較Fig. 2 Comparison of relative content and total peak area of MVOCs under different extraction conditions

如圖2所示，隨著萃取時間延長，酯類、萜烯類和烴類物質(zhì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；而醇、酮、醛類物質(zhì)則隨著提取時間延長，提取效率一直升高，但30 min延長到60 min其相對含量顯著升高，而60 min到90 min升高幅度不大。總峰面積的變化規(guī)律與醇、酮、醛類物質(zhì)變化規(guī)律相似，隨著時間的延長，提取效率升高，但60 min到90 min提升幅度不大。因此，綜合考慮提取效率和高效省時問題，最終選擇60 min為炭黑曲霉MVOCs的最佳萃取時間。

2.4 方法學(xué)評價

采用上述建立的提取檢測方法，參考Jeleń等[34]檢測到的炭黑曲霉MVOCs結(jié)果，選取各類物質(zhì)中含量較高的組分標(biāo)準(zhǔn)品進行方法學(xué)評價實驗。結(jié)果如表1所示，線性回歸方程在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，線性良好，回歸系數(shù)均高于0.99。加標(biāo)回收率均在80%～120%之間，符合方法學(xué)要求。全部標(biāo)準(zhǔn)品的LOD值在0.01～0.05 mg/L之間；LOQ值在0.03～0.17 mg/L之間?？梢娫摲椒ǖ撵`敏度較高，對于真菌生長初期的痕量揮發(fā)性組分也能準(zhǔn)確定量。

表1 MVOCs加標(biāo)回收率、線性回歸方程以及回歸系數(shù)Table 1 Recoveries, linear regression equations and regression coefficients of MVOCs

2.5 炭黑曲霉MVOCs分析鑒定

圖3 炭黑曲霉GC-MS總離子流圖Fig. 3 TIC chromatograms of MVOCs from A. carbonarius

實驗采用上述建立的提取方法，結(jié)合GC-MS對SD菌和AF菌兩株炭黑曲霉菌培養(yǎng)5 d過程中的MVOCs進行檢測。如圖3所示，共檢測到32 種MVOCs。在這些MVOCs中，醛類物質(zhì)1 種，酮類物質(zhì)1 種，醇類物質(zhì)2 種，酯類物質(zhì)6 種，半萜烯類物質(zhì)10 種，烴類物質(zhì)11 種和環(huán)化二縮酸酐物質(zhì)1 種。表2列出了全部物質(zhì)的定性方式、保留指數(shù)。所有物質(zhì)經(jīng)過NIST庫比對，相似度均在800以上，計算出的保留指數(shù)與文獻進行比對，差值均在50以內(nèi)，此外對于有標(biāo)樣的組分還根據(jù)保留時間進一步定性。因而本方法對檢測到的32 個MVOCs定性準(zhǔn)確。

兩株炭黑曲霉生長過程中MVOCs的定量情況如表2所示。首先，2 株曲霉均檢測到3-辛酮、2-辛醛、1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1醇。這與先前研究中報道的C8化合物相一致[21-22]。這些C8類物質(zhì)呈現(xiàn)蘑菇氣味，被作為食品腐敗的標(biāo)志性物質(zhì)[22]。且炭黑曲霉中檢測到的這些C8化合物含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，均在生長到第3天時達到最高值，這可能與第3天霉菌開始產(chǎn)孢、產(chǎn)毒素有著某種關(guān)聯(lián)。其次，在2 株炭黑曲霉中檢測到的酯類物質(zhì)均為脂肪酸甲酯，包括辛酸、4-癸烯酸、十五烷酸、棕櫚酸、亞油酸和油酸。在本實驗中，酯類物質(zhì)在真菌生長第2天的時候大量合成，第3天總量降低，而第3天時炭黑曲霉的黑色孢子開始產(chǎn)生，其代謝可能與真菌產(chǎn)孢相關(guān)。2 株炭黑曲霉共檢測到11 種半萜烯類化合物，均檢測到了反式橙花叔醇，其含量變化規(guī)律一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。另外AF菌種還檢測到了柏木烯、羅漢伯烯、長蒎烯、花柏烯、雪松烯等，SD菌中還檢測到β-法尼烯。苯乙烯是2 種炭黑曲霉均產(chǎn)生的烴類物質(zhì)，在2 株菌生長過程中，其含量變化規(guī)律一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在第4天達到最大值。其他10 種烴類物質(zhì)在不同的真菌中被檢測到[35]。

表2 炭黑曲霉MVOCs及其保留指數(shù)、定性方法和氣味描述Table 2 Retention index and odor description of MVOCs

將檢測到的MVOCs，按照其嗅覺感官特征描述（表2）進行分類，可以將其劃分為霉味、蘑菇味、木頭味、化學(xué)烴味、脂肪味、水果味、草本味7 大類物質(zhì)。將2 種菌中5 d生長過程中檢測到的MVOCs按照上述感官特征分類進行匯總，根據(jù)其含量之和繪制雷達圖，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看到，在5 d生長期內(nèi)，2 種炭黑曲霉所產(chǎn)生的MVOCs總量均具有明顯差異。盡管2 種菌生長過程中在不同的感官特性上的積累各有不同，但是具有蘑菇味的揮發(fā)性成分在2 種菌含量均為最高，這種高濃度的積累在兩種菌生長到第3天時表現(xiàn)最為明顯。蘑菇氣味的貢獻者主要是1-辛烯-3-醇，它是霉菌產(chǎn)生的典型MVOCs，可作為食品腐敗的標(biāo)志物[22]?；瘜W(xué)烴氣味化合物的積累僅次于蘑菇氣味成分積累，2 株菌表現(xiàn)的規(guī)律一致，從第2天達到顯著積累后，化學(xué)烴類揮發(fā)性成分就一直保持著較高水平的穩(wěn)定存在。綜上可知，2 株菌生長過程中產(chǎn)生的MVOCs具有顯著差異，其種類和含量是不斷變化的，但二者具有一定的共性。這與Poliziz等[18-19]的研究結(jié)果一致，微生物的MVOCs可能與微生物毒素的產(chǎn)生有一定相關(guān)性，可作為食品污染指示劑，用來判定食品是否發(fā)生腐敗或發(fā)生腐敗的程度。

圖4 兩株菌MVOCs感官特征雷達圖Fig. 4 Spider graphs for MVOCs from two strains

3 結(jié) 論

本實驗采用SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)建立了一種檢測炭黑曲霉生長過程中MVOCs的檢測方法：選用3 種涂料復(fù)合萃取頭（DVB/CAR/PDMS）、萃取溫度60 ℃、萃取時間60 min。對2 株不同的炭黑曲霉MVOCs進行了分析，結(jié)果共檢測到32 種揮發(fā)性組分，其中有1 種醛類物質(zhì)、1 種酮類物質(zhì)、2 種醇類物質(zhì)、6 種酯類物質(zhì)、10 種半萜烯類物質(zhì)、11 種烴類物以及1 種環(huán)化二縮酸酐物質(zhì)。通過對上述MVOCs的檢測可以發(fā)現(xiàn)，2株炭黑曲霉在生長過程中，MVOCs的種類和含量均不斷變化，并在不同生長期其揮發(fā)性成分表現(xiàn)出蘑菇味、化學(xué)烴味等不同的感官特性，證明挖掘其生長期間的標(biāo)志性揮發(fā)性產(chǎn)物，可以為食品微生物污染的快速檢測提供依據(jù)。

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