王振宇，葛勝晗，周阿容，孔子浩，曾紹校，鄭寶東，林少玲*，胡嘉淼*

（福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

蓮是一個重要的特色農(nóng)產(chǎn)品，在中國已有幾千年歷史，被廣泛栽培和食用，主要分布在浙江、江蘇、江西、湖南、湖北、河北、福建[1]，以湖南湘蓮、福建建蓮、浙江衢蓮為上品。蓮的多種組織器官如花、胚、胚乳、子房、葉片等富含多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、活性多糖、多酚類物質(zhì)以及礦物質(zhì)等，可對人類的心血管疾病、糖尿病、肥胖和腫瘤等的產(chǎn)生起防治作用[2]，多酚類化合物作為植物特有的功能性成分，在國內(nèi)外雖已有大量研究報道，但大部分考慮了水溶性有機溶劑體系中提取的部分，而殘渣沒有進行分析，而這些殘渣已被發(fā)現(xiàn)含有大量的結(jié)合酚[3-4]。這些酚類成分多與纖維素、蛋白、木質(zhì)素、葡萄糖、酒石酸等以結(jié)合態(tài)的形式存在于植物細胞的初生壁和次生壁中，有機溶劑無法將其萃取出來[5]。Pérez等[6]研究表明在水果中結(jié)合態(tài)多酚所占比60%～90%，Wang Bini等[7]研究表明棗籽中結(jié)合態(tài)多酚含量是游離態(tài)的3 倍多，此外，眾多的體外抗氧化實驗表明，與自由酚相比，不溶性的結(jié)合酚則表現(xiàn)出較高的抗氧化能力[8]，說明結(jié)合態(tài)多酚在植物多酚分析中的重要性。當前結(jié)合酚的提取方法主要有堿法（氫氧化鈉溶液）[9]，以及酸法（鹽酸、硫酸）加熱水解萃取[10]，其中以堿法最為常用，可避免高溫帶來的結(jié)合酚損失。

建寧鮮蓮作為福建特色產(chǎn)品，課題組前期對其進行了大量研究，結(jié)果表明鮮蓮中不僅含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有水溶性多糖、生物堿、類黃酮和超氧化物歧化酶等功能性成分[11]。此外，課題組還對建寧干蓮中游離態(tài)多酚的提取、抗氧化能力、組分鑒定以及抑菌機理進行了探索，結(jié)果表明干蓮中含有一定量的多酚類物質(zhì)且具有較強的抑菌效果[12]，但目前為止有關(guān)鮮蓮中結(jié)合酚的研究鮮見報道，本實驗以建寧鮮蓮為原料，比較不同酸、堿溶劑對鮮蓮結(jié)合酚的提取效果，確定提取溶劑并優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期得到適合鮮蓮結(jié)合酚的最優(yōu)提取方法，另外，結(jié)合不同極性有機溶劑萃取結(jié)合酚提取物，比較其抗氧化活性，為全面評價鮮蓮中結(jié)合酚含量及鮮蓮的高效利用提供了實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

建寧速凍鮮蓮（各成分質(zhì)量分數(shù)為水分46.20%、脂肪1%、膳食纖維3%、碳水化合物5%、蛋白質(zhì)8%、鈣2%、鐵3%、VC 2%）由綠源（福建）食品有限公司提供，樣品真空冷凍干燥至含水率4%以下，粉碎過40 目篩，取篩上物備用。

正己烷、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、碳酸鈉、沒食子酸標準品均為市售分析純；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、福林-酚試劑、α-淀粉酶（40 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、羥自由基測定試劑盒、總抗氧化能力測試盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

鹵素快速水分測定儀 深圳市冠亞電子科技有限公司；真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；高速粉碎機 浙江紅景天有限公司；電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；多功能攪拌器、數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；恒溫水浴振蕩器蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；純氮 福州華鑫達工業(yè)氣體有限公司；紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)合酚的提取[13-14]

將鮮蓮真空冷凍干燥，研磨成粉，加入蛋白酶4 mg/g、α-淀粉酶60 U/g，81.6 ℃加水振蕩酶解3 h，酶解結(jié)束后，再加無水乙醇至乙醇體積分數(shù)為50%，繼續(xù)攪拌2.45 h，隨后離心（4 000 r/min，10 min），棄去上清液，殘渣用同樣方法提取2 次，濾出上清液，殘渣凍干。稱2 g鮮蓮殘渣置于加有磁力攪拌器的三角瓶，加入提取試劑，室溫邊攪拌邊氮氣消化10 min，橡膠塞密封，繼續(xù)攪拌至所需時間，待結(jié)束后將所得水解液冷卻，用6 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，離心（10 000 r/min，5 min），棄去殘渣，所得上清液定容，測定結(jié)合酚含量。

1.3.2 不同極性結(jié)合酚的分離

參照向樂進等[15]分離方法，略有改動。取離心后鮮蓮結(jié)合酚粗提液，進行濃縮，再分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇以體積比1∶1將濃縮液萃取5 次，萃取工藝如圖1所示，萃取液55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，不同極性分離液分別進行真空冷凍干燥，所得粉末貯存在－80 ℃，使用時用水溶解，分別測定不同相的結(jié)合酚含量和抗氧化能力。

圖1 不同極性結(jié)合酚的萃取分離Fig. 1 Extraction and separation of bound polyphenols with solvents of different polarities

1.3.3 不同試劑對鮮蓮結(jié)合酚得率的比較

按照上述工藝，固定條件為提取試劑濃度1 mol/L、料液比1∶20（g/mL）、提取時間1 h，分別使用濃度均為1 mol/L的NaOH溶液、HCl溶液、H2SO4溶液3 種不同的試劑提取鮮蓮結(jié)合酚，比較不同試劑對鮮蓮結(jié)合酚得率影響。

1.3.4 單因素試驗

以NaOH溶液為提取試劑，各因素基本條件固定為NaOH溶液濃度1 mol/L、料液比1∶20（g/mL）、提取時間1 h。改變其中一個條件，分別考察其余條件對提取液中結(jié)合酚得率影響。各因素試驗范圍為NaOH溶液濃度1、2、3、4、5 mol/L，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），提取時間1、2、3、4、5、6 h。

1.3.5 中心組合優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計以NaOH溶液濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）為自變量，結(jié)合酚得率（Y）為響應值進行3因素3水平的中心組合試驗，具體因素與水平見表1。

表1 中心組合試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in central composite experiments

1.3.6 鮮蓮結(jié)合酚得率的測定

1.3.6.1 標準曲線的繪制

參照卜彥花等[16]的測定方法，略有改動。準確稱取0.500 0 g沒食子酸溶于蒸餾水中，定容至100 mL，取原液5 mL稀釋定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為250 μg/mL的沒食子酸標準溶液，繼續(xù)稀釋得質(zhì)量濃度分別為200、150、100、50、15 μg/mL的沒食子酸標準溶液。吸取0.1 mL沒食子酸標準溶液，加入1.5 mL稀釋10倍的福林-酚試劑混勻，靜置5 min后加入1.5 mL 6 g/100 mL Na2CO3溶液，再將混合液置于70 ℃恒溫水浴中保溫10 min。隨后立即將溶液置于冰浴中冷卻至室溫，于725 nm波長處測定吸光度，重復3 次。根據(jù)沒食子酸溶液質(zhì)量濃度和吸光度，繪制標準曲線，得到的回歸方程為Y=0.004 9X＋0.065（R2=0.999 1）。

1.3.6.2 樣品結(jié)合酚得率的測定

取0.1 mL的樣品溶液，加入1.5 mL稀釋10 倍的福林-酚試劑混勻，靜置5 min后加入1.5 mL 6 g/100 mL Na2CO3溶液，再將混合液置于70 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min。隨后立即將溶液至于冰浴中冷卻至室溫，于725 nm波長處測定吸光度，重復3 次。利用公式（1）計算樣品中結(jié)合酚得率：

式中：C為沒食子酸溶液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為溶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為鮮蓮子渣質(zhì)量（干質(zhì)量）/g。

1.3.7 萃取相結(jié)合酚含量及抗氧化活性測定

1.3.7.1 萃取相結(jié)合酚含量的測定

取凍干后各萃取相粉末1 g，加水溶解配制成100 mg/mL的溶液，參考1.3.6節(jié)方法進行不同極性部分中結(jié)合酚含量的測定，其結(jié)果以每克萃取物中結(jié)合酚質(zhì)量計。

1.3.7.2 DPPH自由基清除率的測定[17-18]

將不同相凍干后所得結(jié)合酚粗品，用水溶解并稀釋成不同質(zhì)量濃度（3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL），取各質(zhì)量濃度稀釋液1 mL，加入3 mL用甲醇溶解的DPPH（0.1 mmol/L），室溫下避光靜置30 min，于517 nm波長處測定其吸光度As，以甲醇代替樣品液為空白測定其吸光度Ac，重復3 次。按式（2）計算DPPH自由基清除率：

式中：As為1 mL樣品溶液＋3 mL DPPH溶液的吸光度；Ac為1 mL甲醇溶液＋3 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.7.3 總抗氧化能力的測定

按總抗氧化能力檢測試劑盒要求準備工作液。取1 mL各極性部分萃取物稀釋液置于試管中，加入檢測試劑2.0 mL，混合均勻，于37 ℃恒溫水浴箱反應30 min，于520 nm波長處測定吸光度。定義37 ℃每分鐘每毫升樣品液反應體系的吸光度每增加0.01時為一個抗氧化能力單位[19]，按式（3）進行計算：

式中：As為樣品的吸光度；Ac為空白組吸光度；V1為反應液總體積/mL；V2為取樣體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.7.4 羥自由基清除率的測定

按羥自由基測試盒說明書加樣、混勻，最后室溫放置20 min，雙蒸水調(diào)零，測定體系550 nm波長處的吸光度。按式（4）計算鮮蓮結(jié)合酚對羥自由基清除率：

式中：As為樣品的吸光度；Ac為空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016、Origin 8.5軟件進行處理，差異顯著性分析使用DPS9.5軟件進行，P小于0.05為具有統(tǒng)計學意義，中心組合法試驗數(shù)據(jù)使用Design Expert 8.0.5軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取試劑對鮮蓮結(jié)合酚得率的影響

圖2 提取試劑對鮮蓮結(jié)合酚得率的影響Fig. 2 Effects of solvents on extraction of bound polyphenols from fresh lotus seeds

由圖2可以看出，NaOH溶液作為提取試劑所得鮮蓮結(jié)合酚得率遠遠大于HCl和H2SO4所得得率，符合Kim等[20]研究結(jié)論：與酸法相比，堿法更適合結(jié)合酚的提取，可顯著提高結(jié)合酚的含量。因為雖然酸處理可以有效地破壞糖苷鍵，而對酯鍵的破壞力微乎其微，采用堿水解卻可使酚酸與細胞壁相連的酯鍵斷裂，使酚類化合物得以從多酚-多糖等復合物中釋放出來[21]，因此選擇NaOH溶液作為提取試劑。

2.2 單因素試驗結(jié)果

圖3 NaOH溶液濃度對鮮蓮結(jié)合酚得率的影響Fig. 3 Effect of NaOH concentration on extraction of bound polyphenols from fresh lotus seeds

如圖3所示，NaOH溶液濃度對結(jié)合酚得率影響顯著（P＜0.05），NaOH溶液濃度在1～3 mol/L范圍內(nèi)，隨著NaOH溶液濃度的增加，結(jié)合酚得率呈增加趨勢，適當堿液濃度能夠水解酚類化合物與細胞壁之間的醚鍵和酯鍵，促進結(jié)合酚的釋放，但隨著NaOH溶液濃度的繼續(xù)增加，結(jié)合酚得率逐漸降低，可能是由于堿液濃度過高，造成提取液黏度增大，不利于過濾、離心，影響結(jié)合酚得率[22]，另外，酚類化合物在苯環(huán)上具有羥基，處于強堿環(huán)境中易發(fā)生電離現(xiàn)象，也會造成結(jié)合酚的損失[23]。White等[24]研究證明有效的釋放結(jié)合酚類物質(zhì)NaOH溶液濃度為1～4 mol/L。故選NaOH溶液濃度為3 mol/L。

由圖4可見，結(jié)合酚得率隨提取試劑用量的增加差異顯著（P＜0.05），在1∶20（g/mL）時達到最大值，隨后逐漸減小最后趨于穩(wěn)定?？赡茉蚴墙Y(jié)合酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿等大分子通過共價鍵進行結(jié)合，而堿液可以起到破壞結(jié)合鍵的作用，釋放出結(jié)合酚，因而在一定范圍內(nèi)，通過增加溶劑的用量可以促進結(jié)合酚的溶出[21,25]。但隨著溶劑的用量增大，溶液濃縮時能耗也增大，同時釋放出的酚類物質(zhì)在后續(xù)處理過程中更易受到氧化，再者，蛋白質(zhì)、糖等水溶性物質(zhì)易大量溶出，黏度增大，阻礙酚酸的水解分離，降低得率，而當溶劑用量達到一定程度，多酚的溶出此時也已達極限，這時結(jié)合酚得率將保持相對穩(wěn)定狀態(tài)[26-27]。故選料液比為1∶20（g/mL）。

圖4 料液比對鮮蓮結(jié)合酚得率的影響Fig. 4 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of bound polyphenols from fresh lotus seeds

圖5 提取時間對鮮蓮結(jié)合酚得率的影響Fig. 5 Effect of extraction times on the rate of bound polyphenols from fresh lotus seeds

圖5顯示：隨著提取時間的延長，結(jié)合酚得率逐漸增加，當提取時間達到3 h時，結(jié)合酚得率達到最大值；此后隨著提取時間的繼續(xù)延長，結(jié)合酚得率又呈下降趨勢。這可能是由于過短的提取時間不能使與結(jié)合酚相連的化學鍵完全斷裂，而提取時間過長，又會使部分結(jié)合酚被氧化，能耗量增大，雜質(zhì)大量溶出，不利于分離提取[22,28]。故選取提取時間為3 h。

2.3 中心組合試驗結(jié)果

2.3.1 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果

回歸模型的建立及顯著性檢驗分別以結(jié)合酚得率為指標，對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合得到鮮蓮結(jié)合酚的提取工藝的數(shù)學模型回歸方程：Y=8.09－0.34A＋0.45B＋0.43C－17.500×10－4AB－0.14AC＋0.060BC－1.08A2－0.16B2－0.37C2，其中Y為結(jié)合酚得率/（mg/g），A、B、C分別為NaOH溶液濃度、料液比、提取時間。回歸模型經(jīng)方差分析進行顯著性及擬合度檢驗如表3所示。

表2 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Central composite design with response variable

表3 結(jié)合酚得率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，結(jié)合酚得率的回歸模型P值小于0.000 1達到極顯著水平，失擬項P值為0.119 6不顯著，決定系數(shù)R2值為0.979 6，說明該方程與實際情況相符，可以充分地反映出各因素與響應值的真實關(guān)系，NaOH溶液濃度（A）、料液比（B）和提取時間（C）都達到極顯著水平，說明各因素對鮮蓮結(jié)合酚得率有著顯著影響，而AB、AC、BC影響都不顯著，這說明各因素之間交互作用很小。

2.3.2 交互作用分析

通過所得回歸方程，考察擬合響應面的形狀，繪制出響應面立體分析圖和相應等高線圖。從圖6a可以看出，結(jié)合酚得率與料液比和NaOH溶液濃度具有明顯的二次拋物線關(guān)系，隨著料液比和NaOH溶液濃度的增加，結(jié)合酚得率呈現(xiàn)先增加后開始有所下降的趨勢，這可能是由于結(jié)合酚的萃取已達到飽和，增加NaOH溶液的量不會提高結(jié)合酚的萃取量，而溶液pH值過高對多酚的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響[29]。當NaOH溶液濃度和料液比向峰值方向移動時，料液比等高線密度明顯變小，取料液比小時等高線密度較稀疏，當料液比達到1∶20（g/mL）以上時，響應面變陡，等高線密度變密，表明較高料液比對響應值的影響顯著，NaOH溶液濃度則取較小值時曲面較陡，等高線密度較密，表明NaOH溶液濃度取較小值時對鮮蓮結(jié)合酚影響顯著。圖6b顯示料液比處于零水平時，NaOH溶液濃度和提取時間的交互作用。在較低的因子水平時，隨著NaOH溶液濃度的增加和提取時間的延長，結(jié)合酚得率逐漸升高，當NaOH溶液濃度為3 mol/L，提取時間為3 h左右，結(jié)合酚得率達到較大值，但超過一定范圍，隨著提取時間的延長結(jié)合酚得率逐漸減少，這可能是由于結(jié)合酚部分結(jié)構(gòu)因攪拌時間過長被破壞[30]。由圖6c可知，隨著提取時間的延長和料液比的增加，結(jié)合酚的得率有所提高，但總體曲面圖的曲線表現(xiàn)較為平緩，二者交互作用并不明顯。

圖6 各因素對結(jié)合酚得率的交互影響Fig. 6 Interactive effects of various factors on extraction of bound polyphenols

2.3.3 最優(yōu)工藝驗證實驗

通過Design Expert 8.0.5軟件的優(yōu)化功能，在回歸模型的基礎(chǔ)上得出鮮蓮中結(jié)合酚得率最優(yōu)工藝參數(shù)為NaOH溶液濃度2.8 mol/L、料液比1∶25（g/mL）、提取時間3.7 h時，室溫提取所得結(jié)合酚得率理論值為（8.598±0.170）mg/g。在此工藝條件下進行驗證實驗，實際所得結(jié)合酚得率為（8.483±0.063）mg/g，這與預測結(jié)合酚得率基本一致，說明本優(yōu)化工藝具有可行性。

2.4 萃取相結(jié)合酚含量及抗氧化能力分析

2.4.1 萃取相結(jié)合酚含量

鮮蓮結(jié)合酚的不同極性部分的結(jié)合酚含量存在顯著性差異（P＜0.05），如圖7所示。其中以正丁醇萃取相結(jié)合酚含量最高，為1.62 mg/g，其次為氯仿萃取相（1.57 mg/g），但兩者無顯著性差異，而水相的結(jié)合酚含量最低，為0.98 mg/g，但與乙酸乙酯相結(jié)合酚含量所得結(jié)果（1.04 mg/g）也無顯著性差異。由于結(jié)合酚存在著極性差異，通過不同有機溶劑中能被選擇性萃取，使不同萃取相所含結(jié)合酚含量有所差別。

圖7 鮮蓮中不同極性提取物結(jié)合酚含量Fig. 7 Contents of different polar bound polyphenols in fresh lotus seeds

圖8 鮮蓮不同極性提取物中結(jié)合酚對DPPH自由基的清除能力Fig. 8 DPPH scavenging effects of different polar bound polyphenols from fresh lotus seeds

2.4.2 DPPH自由基清除率由圖8可知，正丁醇層、乙酸乙酯層、氯仿層以及水層蓮子渣結(jié)合酚對DPPH自由基均具有較強的清除效果，且隨其結(jié)合酚質(zhì)量濃度的增加而不斷增強。但它們的清除能力又不完全相同，正丁醇相的抗氧化能力相對較強，其次為乙酸乙酯相，而水相相對較弱。50%清除率時，水相結(jié)合酚質(zhì)量濃度最大，乙酸乙酯相結(jié)合酚質(zhì)量濃度其次，而正丁醇相結(jié)合酚質(zhì)量濃度最小。由此可見，正丁醇相結(jié)合酚的抗氧化力最強。

2.4.3 總抗氧化能力

圖9 鮮蓮不同極性提取物中結(jié)合酚總抗氧化能力Fig. 9 Total antioxidant capacity of different polar bound polyphenols from fresh lotus seeds

由圖9可知，隨著結(jié)合酚質(zhì)量濃度的增加，各萃取相的總抗氧化能力逐步加強，其中以水相的總抗氧化能力最弱，當結(jié)合酚質(zhì)量濃度低于6.25 mg/mL時，以正丁醇相的總抗氧化能力最強，氯仿相與乙酸乙酯相次之，兩者之間并無顯著性差異（P＜0.05），當結(jié)合酚質(zhì)量濃度高于12.5 mg/mL，乙酸乙酯相的總抗氧化能力顯著上升，最大，其次為氯仿相、正丁醇相。

2.4.4 羥自由基清除能力

圖10 鮮蓮不同極性提取物中結(jié)合酚對羥自由基的清除能力Fig. 10 Hydroxyl radical scavenging effects of different polar bound polyphenols from fresh lotus seeds

由圖10可知，氯仿相與水相在結(jié)合酚低質(zhì)量濃度下對羥自由基具有較強的清除能力，清除率一直保持90%左右，這可能由于羥自由基具有極強的得電子能力，而水相和氯仿相可能含有較多的酸性酚如水楊酸、槲皮素及阿魏酸等，這些成分在水中易發(fā)生電離，失去電子，因此對羥自由基具有強清除能力[31]。正丁醇相與乙酸乙酯相低質(zhì)量濃度下清除能力很弱，但隨著樣品中結(jié)合酚質(zhì)量濃度的增加，清除能力逐漸增強，最終4相保持相當?shù)那宄芰Α?/p>

3 結(jié) 論

不同試劑對鮮蓮結(jié)合酚提取的比較實驗表明，NaOH水解得到的結(jié)合酚得率顯著高于H2SO4和HCl（P＜0.05），說明堿法提取效果優(yōu)于酸法。中心組合優(yōu)化鮮蓮結(jié)合酚提取工藝參數(shù)為NaOH溶液濃度2.8 mol/L、料液比1∶25（g/mL）、提取時間3.7 h，此工藝下所得鮮蓮結(jié)合酚提取液中實際結(jié)合酚得率達（8.483±0.063）mg/g。

抗氧化活性實驗表明，鮮蓮渣各萃取液可清除多種自由基，在一定質(zhì)量濃度范圍呈量效關(guān)系，其中以乙酸乙酯、正丁醇萃取相的抗氧化能力較強，同時采用3 種方法測定各萃取液的抗氧化能力，可達到綜合評價鮮蓮渣提取物中結(jié)合酚的抗氧化活性。研究結(jié)果將為鮮蓮作為保健食品的深入開發(fā)以及鮮蓮結(jié)合酚進一步開發(fā)和利用提供了科學依據(jù)，避免資源浪費。

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