潘艷儀，邱德義，陳 健，楊維東，岳巧云,*

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528403）

近年來，國際貿(mào)易及國內(nèi)市場上各種肉類假冒以及以次充好的現(xiàn)象時有發(fā)生[1]。經(jīng)過2013年歐盟的“馬肉風(fēng)波”，人們對食品成分的真實性越來越關(guān)注[2]。食品摻假造假問題嚴(yán)重危害了人類健康和廣大消費者的利益，引發(fā)宗教矛盾，甚至影響國家之間的關(guān)系[3]。隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，食品摻假技術(shù)不斷翻新，迫使食品成分真實性的鑒定技術(shù)不斷地發(fā)展和改善。由此，可靠、有效的動物源性物種鑒定方法、技術(shù)是識別食品摻假造假的有力技術(shù)保障。

在過去的20年，DNA的分子檢測技術(shù)快速發(fā)展并應(yīng)用，如分子指紋圖譜技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。PCR技術(shù)中的實時熒光定量PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性PCR和巢式PCR技術(shù)等在食品成分物種鑒定領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用[4-7]。其中，普遍使用的是具有高靈敏度的實時熒光定量PCR技術(shù)。但因為該技術(shù)使用特異的探針和引物，只能猜測性地鑒定特定某個物種，不適合于復(fù)雜未知的動物源性多成分的鑒定，而市場加工食品中可能同時混有多種成分。此外，有些物種的特異性探針和引物難以設(shè)計，從而成為了多種動物源性成分鑒定的應(yīng)用瓶頸。

自2003年，加拿大動物學(xué)家Paul Hebert教授首次提出DNA條形碼的概念，分子分類學(xué)方法以及分子鑒別技術(shù)在生物物種鑒定方面發(fā)揮了重要作用[8-9]。近年來，隨著DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的不斷完善，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)媒介生物的物種鑒定[10]，并開始應(yīng)用于動物源性食品成分的鑒定[11-15]。

DNA條形碼是源于線粒體基因組中細胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase I ，COI）基因的一段658 bp的DNA序列。此外，DNA條形碼的適用范圍很廣（從低等的節(jié)肢動物到高等的哺乳動物），有較大的通用性，可以同時適用于多種動物種類的鑒定。而一些深加工食品的DNA會存在不同程度的降解[16]，其中某些物種成分可能會由于DNA高度降解而不能被檢出。為了適用加工食品尤其是深加工食品中動物源性成分的檢測，微型的DNA條形碼的研發(fā)是該技術(shù)提升的一個突破口。2008年，DNA的微型條形碼被首次提出，對久置的生物標(biāo)本實現(xiàn)了高效的物種鑒定[8]。繼而，也有研究者使用coi基因和12S、16S核糖體RNA基因的短片段對動物膳食和飼料樣品進行了物種鑒定[11]，但各研究者所使用的短片段不如標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼片段那樣非常統(tǒng)一，況且目前仍沒有標(biāo)準(zhǔn)的微型DNA條形碼用于動物源性食品成分的鑒定[17]。因此，設(shè)計具有適度保守性和通用性的微型DNA條型碼應(yīng)用于食品成分（尤其是深加工食品）的鑒定很有必要。

本研究針對常見的經(jīng)濟動物物種，基于coi基因序列設(shè)計了一對通用引物，結(jié)合微型DNA條形碼和克隆測序技術(shù)對混合的肉樣品成分實現(xiàn)一次性準(zhǔn)確、高效的鑒定。以便進一步應(yīng)用于未知成分的肉糜制品或深加工肉類食品的多種肉源性成分的檢出。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本的選取和種類的確定

選取了11 種常見的經(jīng)濟物種以驗證引物的適用性和通用性。這11 個物種的新鮮肉類樣品從廣東中山市某市場購得，并初步判定為鯰魚、草魚、馬頭魚、藍圓鲹、家雞、鷓鴣、黃牛、水牛、家豬、綿羊和對蝦。

使用DNA條形碼的分子鑒定技術(shù)確定樣品的物種[10]。用coi通用引物（LCO1490、HCO2198）[18]擴增出目的片段后，通過Sanger測序獲得658 bp目的序列，再于BOLD數(shù)據(jù)庫（生命條形碼數(shù)據(jù)庫http://www.boldsystems.org/）進行序列比對，以與參考序列達到99.8%相似度為標(biāo)準(zhǔn)確定樣品物種。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑盒（目錄號DP304）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（目錄號DP210）、克隆試劑盒（目錄號VT202-02）、重組菌落鑒定試劑盒（目錄號VI102）、dNTP、Loading buffer、DNA Marker II、SYBR Green I天根生化科技（北京）有限公司；Ex-Taq DNA聚合酶大連寶生物工程有限公司；引物由Thermo Fisher Scientific Inc廣州公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoPico 17微量臺式離心機 美國Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀 北京科學(xué)深藍科技有限公司；Veriti 96梯度PCR儀 美國Applied Biosystems公司；MD-02N-220金屬浴 美國Major Science公司；Alliance 4.7 Thermo UVITEC凝膠成像儀 英國Uvitec公司；量程可調(diào)移液器。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

從BOLD和GenBank（美國國立生物技術(shù)信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了140 條源于動物coi基因的序列，包括了28 個屬（石雞屬、原雞屬、鴨屬、雁屬、鯰魚屬、鲇魚屬、黃鱔屬、馬頭魚屬、鯧魚屬、非鯽屬、麗鯛屬、圓鯵屬、鱸魚屬、草魚屬、鰱魚屬、鯉魚屬、鯽魚屬、泥鰍屬、對蝦屬、龍蝦屬、白蝦屬、長臂蝦屬、疣豬屬、豬屬、黃牛屬、水牛屬、山羊?qū)俸脱驅(qū)伲┖?1個動物物種（25 種魚、6 種蝦、10 種家禽、3 種豬、3 種牛和4 種羊）。選取的物種基本上都是常見的作為商品肉食的經(jīng)濟動物及其近緣種，每個物種有2或3條源于不同個體的序列。目的是尋找具有較小同種個體間差異和較大種間差異的區(qū)域，而且引物的位點要有足夠的保守性和通用性。用MEGAv. 6.0.6（分子進化遺傳分析軟件）進行多序列比對[19]，結(jié)合引物設(shè)計的一般原則，選取了一段長度為136 bp目的片段。使用Oligo 7.0對所選引物的特性（引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其他位點錯誤引發(fā)的效率等）進行理論上的分析和評價[20]。再使用BLAST（基本局部比對搜索工具https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢驗引物的特異性。經(jīng)過綜合分析，最終確定了最佳的一對引物序列如下：正向引物為5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，即標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼的正向引物L(fēng)CO1490[18]；反向引物為5’-ACT ATAAAGAAGATTATTACAAAGGC-3’。

1.3.2 引物通用性分析

由于本實驗的正向引物源于標(biāo)準(zhǔn)條形碼的正向引物序列，其引物本身對多種動物物種都具有較高的通用性[8]。為評估這一對引物對所選物種的通用性，對引物的保守位點和引物與各屬內(nèi)物種的同源性進行分析。使用MEGAv. 6.0.6軟件對各屬物種序列的引物區(qū)域與反向引物序列進行多序列比對，對引物位點的核酸堿基組成情況進行整合分析。

1.3.3 樣品前處理和DNA的提取

為了防止不同肉之間的交叉污染，樣品處理前，每把剪刀都經(jīng)高溫高壓處理，并紫外照射30 min，而且在同一次混合操作中，一把剪刀對應(yīng)一種肉。每種肉樣品都要用無菌的剪刀剪取其內(nèi)部肌肉組織。肉類樣品設(shè)為A和H兩組：A組是11 個物種的肉獨立樣品，H組是由上述的11 個物種的生鮮肉等比例混合的樣品。對11 個物種的生鮮肉樣各剪取0.03 g組成A組的獨立樣品。再以同樣的方式對11 種肉類樣品各剪取0.01 g，充分磨碎并混勻形成H組的混合肉樣品。H組中的混合樣品設(shè)置了3 個平行。按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書指導(dǎo)提取全基因組DNA。

1.3.4 PCR擴增條件

A組和H組的樣品經(jīng)DNA提取后，按以下擴增條件獲取目的片段：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、48 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10 倍PCR緩沖液5 μL；正向引物（20 nmol/μL）1 μL；反向引物（20 nmol/μL）1 μL；dNTP（10 nmol/μL）2 μL；Ex-Taq（5 U/μL）1 μL；模板DNA（50 ng/μL）3 μL；無菌水定容到50 μL。

1.3.5 直接測序

把A組11 個獨立的物種樣品的PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物科技有限公司測序，測序引物同擴增引物。使用DNA MAN軟件[21]和MEGA軟件對測序公司返回的序列進行序列拼接和序列處理（去除引物和堿基校對），再進行蛋白質(zhì)翻譯校對無誤后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對和相似度分析，對序列進行物種注釋。

1.3.6 DNA純化

把H組混合肉類樣品的PCR產(chǎn)物進行純化。采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.3.7 克隆測序

采用pGM-T連接試劑盒，按照試劑盒的使用手冊對H組樣品的純化PCR產(chǎn)物進行連接和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后把產(chǎn)物置于37 ℃進行菌液擴大培養(yǎng)1 h，再把菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)過藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落進行陽性克隆檢測，以確定克隆的有效性。最終每個樣品隨機挑選130個陽性菌株送交上海立菲生物科技有限公司測序。以上述方法1.3.5節(jié)同樣的方式對測序結(jié)果進行序列分析和物種注釋。

1.3.8 比對微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的對物種鑒定的效果

基于140 條、51 個物種的coi基因的DNA序列（序列來源與1.3.1節(jié)所述的一致），序列分別處理為長度為136 bp的微型條形碼序列和長度為658 bp的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列，再用MEGA v.6.0.6軟件，選用鄰接（Neighbor joining，NJ）法構(gòu)建進化樹及其默認(rèn)參數(shù)值（P-distance模式、檢測次數(shù)為500等），分別構(gòu)建微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹，以比較微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的對物種鑒定的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的通用性分析

對所選的28 個屬、140 條序列的反向引物區(qū)域的同源性分析情況如表1所示。反向引物序列區(qū)域中共有17 個完全保守位點，分別以“*”標(biāo)記。28 個屬中，共有14 個屬具有較高同源性（少于2 個差異位點）：豬屬、雁屬、鲇魚屬、馬頭魚屬、非鯽屬、鯉魚屬、石雞屬、鯰魚屬、圓鯵屬、草魚屬、鰱魚屬、鯽魚屬、長臂蝦屬和黃牛屬。有4 個屬具有較低同源性（4～5個差異位點）：黃鱔屬、對蝦屬、龍蝦屬和白蝦屬。其余的10 個屬具有中等的同源性（3 個差異位點）。為了進一步檢驗引物的適用性和通用性，選取源于3 種不同的同源性水平的11 個物種（表1中以上標(biāo)“1”標(biāo)記）進行后續(xù)的實驗驗證，擴增的目的片段如圖1所示。

表1 28 個屬內(nèi)物種與引物的同源性Table 1 Sequence homology with primers among species of 28 genera

圖1 11 個物種的目的片段Fig. 1 Target fragments for 11 species

2.2 樣品物種的鑒定

經(jīng)DNA條形碼分子鑒定，11 個樣品的目的序列都能與BOLD條形碼數(shù)據(jù)庫的參考序列達99.8%以上的相似度，達到物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，確定樣品的物種如下：鯰魚、草魚、馬頭魚、藍圓鲹、原雞、石雞、黃牛、水牛、家豬、綿羊和凡納濱對蝦。

2.3 微型DNA條形碼鑒定物種的準(zhǔn)確性

A組的11 個物種的基因組DNA都能被成功提取并高效擴增出長度為136 bp的目的片段，如圖1所示。測序后返回的DNA序列經(jīng)序列處理和分析，并蛋白質(zhì)翻譯校對無誤后，結(jié)合BOLD數(shù)據(jù)庫的參考序列和GenBank的匹配序列，所有目的片段和對應(yīng)的兩種序列都有100%的相似度，即對每個物種的鑒定都準(zhǔn)確地達到了種的水平[8,22]（表2）。

表2 11 個樣品物種的微型DNA條形碼的鑒定結(jié)果Table 2 Identification of 11 species based on mini-DNA barcode

2.4 混合肉樣品的克隆測序結(jié)果

H組3 個平行的混合肉樣品中的390 個陽性克隆經(jīng)過Sanger測序后，其中絕大部分的陽性克隆都能被成功測序并獲得高質(zhì)量的測序結(jié)果，只有3.6%的陽性克隆測序失敗或者序列比對結(jié)果不佳，說明本實驗的克隆測序法的陽性克隆具有較高的有效性。經(jīng)序列處理和序列分析后，各物種的微型條形碼序列（136 bp）幾乎都能與數(shù)據(jù)庫中的參考序列達到100%的相似度，說明微型條形碼與克隆測序法結(jié)合后，對物種鑒定依然具有較高的準(zhǔn)確度。綜合3 個平行樣品，除了原雞和藍圓鲹，其余9 個物種皆一并檢出（圖2）。進一步分析各個物種的序列豐度，不同物種之間被檢出的概率差異較大?；旌蠘悠分婿T魚、石雞、黃牛和綿羊物種的檢出概率較高，其檢出概率的范圍為7.7%～54.0%，而其余物種的檢出概率的范圍為0%～1.5%（按3 個平行樣品物種序列數(shù)的均值計算）。

圖2 混合樣品各物種被檢出的陽性克隆數(shù)Fig. 2 Number of detected positive clones of each specie from mixed meat samples

2.5 微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的NJ樹的比較分析

基于140 條51 個常見動物經(jīng)濟物種的coi基因序列，構(gòu)建出微型條形碼（136 bp）與標(biāo)準(zhǔn)條形碼（658 bp）的NJ樹見圖3。由圖3a可見，28 個不同的屬（每個屬已在方法的1.3.1節(jié)中一一列舉）都能得到明確的區(qū)分。除了原雞屬、雁屬、亞口魚屬、羅非魚屬和綿羊?qū)賰?nèi)的物種序列之間有較高的相似度，其他的21個屬內(nèi)各物種的種間距離基本都大于2%，達到了物種區(qū)分的界限[22]。屬內(nèi)種間差異較小的物種有：原雞和灰原雞，雪雁、豆雁、灰雁和白額雁，莫桑比克羅非魚和尼羅羅非魚，黑鯽和鯽魚，扁吻亞口魚和圣安娜亞口魚，銀鯧魚和翎鯧魚以及落基山脈大角羊和白大角羊（圖3已標(biāo)注）。另一方面，除銀鯧魚外，其余的50 個物種種內(nèi)的不同個體的序列之間都擁有高于98%的相似度，即個體差異小于種間差異，達到種內(nèi)保守。標(biāo)準(zhǔn)條形碼的NJ樹（圖3b）的各屬內(nèi)物種差異較小的物種較少，但原雞屬、雁屬及綿羊?qū)賰?nèi)的種間差異也小于2%（圖3已標(biāo)注）。種內(nèi)個體差異較大的物種較多，包括了銀鯧魚、阿氏六須鯰和鰱魚。

圖3 微型條形碼（a）和標(biāo)準(zhǔn)條形碼（b）的NJ進化樹（P-distance模式）Fig. 3 Neighbor joining trees of mini-barcode and standard barcode(P-distance model)

比對分析微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)的條形碼的NJ樹，兩者在區(qū)分所選物種的種間和種內(nèi)的能力上有高度的一致性。說明微型條形碼盡管片段較短，也依然能保留標(biāo)準(zhǔn)條形碼基本的物種分類能力，能對所選的大部分的物種實現(xiàn)較好的物種分類和鑒定。

3 討 論

3.1 引物的通用性

經(jīng)140 條序列的反向引物區(qū)域同源性的分析，26 個引物位點中有17 個完全保守位點。雖然引物3末端的5 個堿基不是連續(xù)的完全保守位點，但以G、C堿基（完全保守位點）為末端的引物一般與模板結(jié)合時具有較高的穩(wěn)定性，能增加引物與模板的總體結(jié)合力。而且后續(xù)的驗證引物的適用性和通用性的實驗表明引物能對不同引物同源性水平的11 種個肉類物種（豬、牛、羊、雞、魚和蝦）的目的序列進行高效的擴增，并得到高質(zhì)量的序列測序結(jié)果。雖然引物的同源性分析反映了該引物對所選的51 個動物經(jīng)濟物種有一定的通用性，且對所選的11 個物種序列有良好的擴增效率，但仍需進一步的實驗以對引物通用性進行更全面的檢驗。

3.2 克隆測序法的檢測效果

在混合樣品中9 個物種一并檢出并得到準(zhǔn)確鑒定，物種成分的檢測在總體達到了較高的檢出效率，但仍然有2 個物種未能檢出。由于克隆法自身的局限性，難以對多組分樣品的成分進行全面檢出。進一步分析各物種被檢出的序列豐度，不同物種之間的檢出概率差異較大，這可能源于混合樣品的各個成分中在PCR擴增過程中存在競爭效應(yīng)[23-24]。對于那些具有相對較低的擴增效率的物種，則呈現(xiàn)較低的檢測概率。另一方面，克隆測序法對混合樣品成分的檢測具有一定的隨機性，而導(dǎo)致了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較低。這與挑取陽性克隆的相對豐度以及選取陽性克隆的隨機性有關(guān)。

3.3 微型DNA條形碼的適用性和前景性

選取的11 個物種皆能通過本實驗設(shè)計的通用引物成功擴增出136 bp的目的片段并得到準(zhǔn)確的物種鑒定（皆與數(shù)據(jù)庫的目的物種序列有100%的相似度），說明該微型DNA條形碼可準(zhǔn)確鑒定這11 種肉類成分，可進一步應(yīng)用于深加工食品或復(fù)雜成分食品的多種動物源性成分的檢測。

此外，經(jīng)過微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼的鄰接樹的對比分析，微型條形碼對所選的51 個常見經(jīng)濟物種的分類鑒定能力與標(biāo)準(zhǔn)條形碼高度相似。由于微型條形碼的序列僅有136 bp，對某些在coi基因片段中具有極少差異位點的近緣物種（2.5節(jié)）則難以區(qū)分。除去種間差異較小的8 個物種和種內(nèi)個體差異較大的1 個物種，該微型條形碼對其余的42 個物種都具有較好的種間和種內(nèi)的區(qū)分能力。針對克隆測序法難以對于含有較多成分樣品達到全面檢出的情況，近年來，已有一些研究者開始借助二代測序平臺對多種動植物源性成分進行鑒定[25-27]。由于現(xiàn)今市場上常用的二代測序平臺有讀長長度限制[28-29]，盡管采用PE300的測序策略，最多只能檢測長度為550 bp的擴增片段。所以，標(biāo)準(zhǔn)的條形碼658 bp由于長度過長而不能直接應(yīng)用于二代測序平臺。因此，也有一些研究者結(jié)合一種或多種微型條形碼和二代測序技術(shù)，進而對復(fù)雜的、未知的樣品成分的進行檢測和鑒定，如蜂蜜成分的鑒定，花粉混合物的物種來源鑒定及糖果中動物物種成分分析等[29-31]。由于本實驗的微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼在動物物種分類的能力上有高度的一致性，而且長度符合二代測序的讀長要求，所以能進一步與二代測序平臺結(jié)合，進而對復(fù)雜、未知的食品中多種動物源性成分進行全面的檢測和鑒定。

4 結(jié) 論

單個樣品的Sanger測序和混合樣品的克隆測序結(jié)果皆顯示，本實驗研發(fā)的微型條形碼對于多種動物源性物種成分，包括魚、蝦、雞、豬、牛和羊的鑒定有高度的準(zhǔn)確性。克隆測序法能對混合樣品的物種成分達到較高的檢測效率，但同時也存在一些局限性?；谖⑿蜅l形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼在物種分類上高度的一致性，把微型條形碼與二代測序技術(shù)相結(jié)合，是未來在復(fù)雜食品成分快速鑒定的領(lǐng)域中進一步的研究方向。

參考文獻：

[1]GALAL-KHALLAF A, ARDURA A, MOHAMMED-GEBA K, et al.DNA barcoding reveals a high level of mislabeling in Egyptian fish fillets[J]. Food Control, 2014, 46： 441-445. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.06.016.

[2]BALLIN N Z. Authentication of meat and meat products[J]. Meat Science, 2010, 86(3)： 577-587. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.06.001.

[3]SYNTESA H L. Communicating food safety, authenticity and consumer choice. Field experiences[J]. Recent Patents on Food Nutrition & Agriculture, 2013, 5(1)： 19-34. DOI：10.2174/2212798411 305010005.

[4]OKUMA T A, HELLBERG R S. Identification of meat species in pet foods using a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay[J].Food Control, 2015, 50： 9-17. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.08.017.

[5]SARRI C, STAMATIS C, SARAFIDOU T, et al. A new set of 16S rRNA universal primers for identification of animal species[J]. Food Control, 2014, 43： 35-41. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.02.036.

[6]HAIDER N, NABULSI I, ALSAFADI B. Identification of meat species by PCR-RFLP of the mitochondrial coi gene[J]. Meat Science,2012, 90(2)： 490-493. DOI：10.1016/j.meatsci.2011.09.013.

[7]ZHANG C. Semi-nested multiplex PCR enhanced method sensitivity of species detection in further-processed meats[J]. Food Control, 2013,31(2)： 326-330. DOI：10.1016/j.foodcont.2012.11.002.

[8]HEBERT P D N, CYWINSKA A, BALLl S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings Biological Sciences, 2003, 270(1512)： 313-321. DOI：10.1098/rspb.2002.2218.

[9]HEBERT P D N, STOECKLE M Y, ZEMLAK T S, et al.Identification of birds through DNA Barcodes[J]. PLoS Biology, 2004,2(10)： e312. DOI：10.1371/journal.pbio.0020312.

[10]岳巧云, 邱德義, 胡佳, 等. DNA條形碼： 醫(yī)學(xué)媒介生物快速準(zhǔn)確鑒定的利器[J]. 檢驗檢疫學(xué)刊, 2013, 23(5)： 60-63. DOI：10.3969/j.issn.1674-5354.2013.05.017.

[11]MALGORZATA N W, PIOTR KRZYSCIN, AGATA P K.The species identification of bovine, porcine, ovine and chicken components in animal meals, feeds and their ingredients, based on COX I analysis and ribosomal DNA sequences[J]. Food Control, 2013,34： 69-78. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.04.014.

[12]MARALIT B A, AGUILA R D, VENTOLERO M F H, et al. Detection of mislabeled commercial fishery by-products in the Philippines using DNA barcodes and its implications to food traceability and safety[J]. Food Control, 2013, 33： 119-125. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.02.018.

[13]GALIMBERTI A, MATTIA F D, LOSA A, et al. DNA barcoding as a new tool for food traceability[J]. Food Research International, 2013,50： 55-63. DOI：10.1016/j.foodres.2012.09.036.

[14]邱德義, 胡佳, 劉德星, 等. DNA條形碼技術(shù)在肉品防欺詐鑒別中的應(yīng)用[J]. 肉類研究, 2013, 27(4)： 40-43.

[15]陳健, 岳巧云, 邱德義. DNA條形碼技術(shù)檢測調(diào)理肉制品摻雜[J]. 肉類研究, 2016, 30(6)： 35-39.

[16]葉可萍, 周光宏, 徐幸蓮, 等. 轉(zhuǎn)基因大豆不同加工過程DNA降解研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(13)： 312-315.

[17]STAATS M, ARULANDHU A J, GRAVENDEEL B, et al. Advances in DNA metabarcoding for food and wildlife forensic species identification[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(17)：4615-4630. DOI：10.1007/s00216-016-9595-8.

[18]FOLMER O, BLACK M, HOEH W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular Marine Biology &Biotechnology, 1994, 3(5)： 294-299.

[19]KUMAR S, NEI M, DUDLEY J, et al. MEGA： a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J]. Briefings in Bioinformatics, 2008, 9(4)： 299-306. DOI：10.1093/bib/bbn017.

[20]RYCHLIK W. OLIGO 7 primer analysis software[J]. Methods in Molecular Biology, 2007, 402： 35-59. DOI：10.1007/978-1-59745-528-2_2.

[21]EDWARDS D J, GRODEVANT N W, LEE P J, et al. DNA-MAN：dynamic natural attributes for synthetic military forces[C]//Systems and Information Engineering Design Symposium, IEEE, 2007： 1-5.DOI：10.1109/SIEDS.2007.4374030.

[22]HEBERT P D, RATNASINGHAM S, DEWAARD J R. Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings： Biological Sciences, 2003, 270(1)：96-99. DOI：10.1098/rsbl.2003.0025.

[23]PENG Q, SATYA R V, LEWIS M, et al. Reducing amplification artifacts in high multiplex amplicon sequencing by using molecular barcodes[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1)： 589-593. DOI：10.1186/s12864-015-1806-8.

[24]BERTOLINI F, GHIONDA M C, D'ALESSANDRO E, et al. A next generation semiconductor based sequencing approach for the identification of meat species in DNA mixtures[J]. PLoS ONE, 2015,10(4)： e0121701. DOI：10.1371/journal.pone.0121701.

[25]TILLMAR A O, DELLl’AMICO B, WELANDER J, et al. A universal method for species identification of mammals utilizing next generation sequencing for the analysis of DNA mixtures[J]. PLoS ONE, 2013,8(12)： e83761. DOI：10.1371/journal.pone.0083761.

[26]CHENG X, SU X, CHEN X, et al. Biological ingredient analysis of traditional Chinese medicine preparation based on high-throughput sequencing： the story for Liuwei Dihuang Wan[J]. Scientific Reports,2014, 4： 5147. DOI：10.1038/srep05147.

[27]QUAIL M A, SMITH M, COUPLAND P, et al. A tale of three next generation sequencing platforms： comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers[J]. BMC Genomics, 2012,13： 341-353. DOI：10.1186/1471-2164-13-341.

[28]SHOKRALLA S, GIBSON J F, NIKBAKHT H, et al. Next-generation DNA barcoding： using next-generation sequencing to enhance and accelerate DNA barcode capture from single specimens[J]. Molecular Ecology Resources,2014, 14(5)： 892-901. DOI：10.1111/1755-0998.12236.

[29]PROSSER S W J, HEBERT P D N. Rapid identification of the botanical and entomological sources of honey using DNA metabarcoding[J]. Food Chemistry, 2017, 214： 183-191. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.07.077.

[30]POMON A, ESCARAVAGE N, BURRUS M, et al. Using metabarcoding to reveal and quantify plant-pollinator interactions[J].Scientific Reports, 2016, 6： 27282. DOI：10.1038/srep27282.

[31]MUNOZ-COLMENERO M, MARTINEZ J L, ROCA A, et al. NGS tools for traceability in candies as high processed food products： ion torrent PGM versus conventional PCR-cloning[J]. Food Chemistry,2017, 214： 631-636. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.07.121.