趙立仙 畢磊 楊錫彤 王光明 何舉

[摘要] 目的 通過分析體檢人群人乳頭瘤病毒（HPV）的感染情況，以了解云南省大理地區(qū)HPV的感染特點(diǎn)。 方法 選取2013年1月～2015年11月大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心接診的女性患者2912例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為13型組（1587例）和21型組（1325例）。其中13型組應(yīng)用熒光探針法進(jìn)行13種高危型HPV檢測(cè)，21型組應(yīng)用分子導(dǎo)流雜交技術(shù)進(jìn)行21型HPV亞型檢測(cè)，并對(duì)兩種檢測(cè)技術(shù)的結(jié)果進(jìn)行比較分析。 結(jié)果 13型組中，檢測(cè)出含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型的陽性患者206例，陽性率為12.98%（206/1587）；21型組中，檢測(cè)出陽性患者246例，陽性率為18.57%（246/1325）；共檢出除低危型HPV43型外的20種亞型；在20種HPV亞型感染中，HPV16型陽性率最高為29.67%（73/246），其次為HPV52亞型21.14%（52/246）。 結(jié)論 云南省大理地區(qū)HPV的感染分布具有異質(zhì)性，兩種檢測(cè)方法的檢出率無差異，檢測(cè)方法的選擇應(yīng)該根據(jù)臨床需要進(jìn)行選擇。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒；分子導(dǎo)流雜交；熒光探針法；宮頸癌

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（a）-0131-04

[Abstract] Objective To understand the characteristics of human papillomavirus （HPV） infection in Dali region of yunnan province by analysis of the infection of HPV in the population of physical examination. Methods From January 2013 to November 2015， 2912 female patients received in Medical Examination Center of the First Affiliated Hospital of Dali University were selected， and divided into 13 type group （1587 cases） and 21 type group （1325 cases） according to the random number table. 13 type group was used to 13 types of high risk HPV detection by real-time PCR， 21 type group was used to type 21 HPV subtype detection by molecular hybridization， and the results of two kinds of detection techniques are compared and analyzed. Results In the 13 type group， a total of 206 cases of positive patients with 13 high-risk subtypes including HPV16， 18， 31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59 and 68 were detected，with a positive rate of 12.98%（206/1587）. In the 21 type group， 246 cases were infected with HPV， with the positive rate of 18.57% （246/1325）. A total of 20 subtypes except low-risk HPV43 were detected. The most common HPV genotypes were HPV16 with the positive rate of 29.67%（73/246）. Second， HPV52 subtype 21.14% （52/246） in 20 types of HPV subtypes. Conclusion The infection of HPV in Dali region， Yunnan Province， has heterogeneity. The detection rate of the two detection methods was not different， and the selection of the detection method should be selected according to the clinical needs.

[Key words] Human papillomavirus； Molecular hybridization； Real-time PCR； Cervical carcinoma

宮頸癌是成年女性第二大常見惡性腫瘤[1-2]，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可以在幾乎所有宮頸癌的標(biāo)本中找到[3]，進(jìn)一步研究顯示HPV感染持續(xù)8～24個(gè)月將引起宮頸上皮內(nèi)瘤變，8～12年后可發(fā)展為宮頸癌[3-4]，并且HPV多重感染的患者組織中與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin比單一感染的患者高[5]，因此針對(duì)成年女性進(jìn)行HPV檢測(cè)顯得尤為重要。目前商業(yè)化的HPV檢測(cè)試劑盒主要包括HPV病毒載量檢測(cè)和HPV分型檢測(cè)。本研選取云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）體檢的2912例患者，分別用13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒與21型HPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者的HPV感染情況，從而了解大理地區(qū)HPV的感染特點(diǎn)以及兩種試劑盒檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)，以便對(duì)HPV感染防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2015年11月我院體檢中心接診的女性患者2912例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為13型組（1587例）和21型組（1325例）。其中13型組年齡17～74歲，平均（39.90±8.37）歲，年齡分布：≤20歲4例，>20～30歲163例，>30～40歲618例，>40～50歲625例，>50～60歲145例，>60歲32例；21型組年齡17～76歲，平均（40.24±8.03）歲，年齡分布：≤20歲2例，>20～30歲119例，>30～40歲487例，>40～50歲570例，>50～60歲126例，>60歲21例，兩組患者年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者及患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 13型組 由婦科的專業(yè)人員用婦科專用陰道窺器和毛刷刷取宮頸脫落細(xì)胞，然后保存在試劑盒專用的保存液中，進(jìn)行13種高危型HPV檢測(cè)。13種高危型HPV型檢測(cè)流程：參照凱普生物科技有限公司“13種高危型HPV核酸檢查試劑盒”的說明書進(jìn)行操作，即宮頸脫落細(xì)胞DNA提取，然后PCR擴(kuò)增（每次擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性和陰性對(duì)照各1個(gè)），擴(kuò)增體系為：PCR混合物17.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，樣品2 μL；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，94℃ 10 s，58℃ 50 s，45個(gè)循環(huán)，38℃ 5 s，檢查結(jié)束后從系統(tǒng)中調(diào)取患者的HPV檢查數(shù)據(jù)作為分析對(duì)象。

1.2.2 21型組 由婦科的專業(yè)人員用婦科專用陰道窺器和毛刷刷取宮頸脫落細(xì)胞，然后保存在試劑盒專用的保存液中，進(jìn)行21型HPV檢測(cè)。HPV21型檢測(cè)流程：參照凱普生物科技有限公司“HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒”的說明書進(jìn)行操作，即宮頸脫落細(xì)胞DNA提取，然后PCR擴(kuò)增（每次擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性和陰性對(duì)照各1個(gè)），擴(kuò)增體系為：PCR混合物23.25 μL，DNA聚合酶0.75 μL，樣品1 μL；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性9 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后用雜交儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交，雜交結(jié)束后進(jìn)行酶標(biāo)顯色，然后參照說明書判斷檢測(cè)樣本的基因型，在擬分析的時(shí)間段的檢查結(jié)束后，從檢測(cè)系統(tǒng)中提取患者HPV數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 儀器和試劑 PCR儀和雜交儀（熒光定量基因擴(kuò)增儀即PCR檢測(cè)系統(tǒng)為TL988型和擴(kuò)增后進(jìn)行雜交用PCR基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀，型號(hào)為DTC型）由西安天隆科技有限公司提供，熒光探針法和導(dǎo)流雜交的相關(guān)試劑由廣州凱普生物科技有限公司提供。13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)涵蓋包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種亞型；21型HPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)包括HPV16、18、31、33、35、39、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68等16種高危型別和HPV6、11、42、44，CP8304（81）等5種低危型別組成的21種亞型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 13型組HPV感染情況

13種高危型HPV感染陽性患者206例，陽性率為12.98%（206/1587）。各個(gè)年齡段的感染情況以≤20歲的感染率最高為50.00%（2/4），其次為>20～30歲的年齡段感染率19.02%（31/163），>50～60歲的年齡段陽性率最低11.03%（16/145），不同年齡段間HPV感染陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 21型組HPV感染情況

21型HPV感染陽性患者246例，陽性率為18.57%（246/1325）。如果排除13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒不能夠檢測(cè)的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）的8種亞型外，陽性率為16.30%（216/1325）。各個(gè)年齡段的感染情況以>20～30歲的感染率最高，為38.66%（46/119），其次為>30～40歲的年齡段感染率19.51%（95/487），>50～60歲的年齡段陽性率最低10.32%（13/126），不同年齡段間HPV感染陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表1。與13種高危型HPV檢出效率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.187）。

2.3 高危亞型和低危亞型感染情況

21型HPV感染陽性的246患者中，高危亞型感染229例，占陽性患者的93.09%（229/246）；低危亞型感染30例，占陽性患者的12.20%（30/246）；高危、低危亞型混合感染13例，占陽性患者的5.28%（13/246）。在21型HPV感染陽性患者中，單一感染201例，占81.71%（201/246）；2種亞型感染37例，占15.04%（37/246）；3種亞型以上感染8例，占3.25%（8/246），其中單個(gè)患者最多混合感染亞型為4種亞型，僅僅1例。

2.4 HPV亞型感染分布

在21種HPV感染的246例陽性患者中，HPV16亞型是高危亞型感染最高的型別，陽性率為29.67%（73/246），其次HPV52亞型為21.14%（52/246）；低危亞型感染中以HPV81亞型最高，為6.10%（15/246），各種亞型的感染情況。見表2。

3 討論

宮頸癌主要由高危亞型HPV持續(xù)感染后，宮頸上皮發(fā)生病理改變而形成[6-9]。大量的臨床和基礎(chǔ)研究及其循證醫(yī)學(xué)的Meta分析均發(fā)現(xiàn)，HPV感染，尤其是高危型感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此要達(dá)到宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和診治，HPV檢測(cè)就顯得尤為重要[10]。由于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳異質(zhì)性密切相關(guān)[7，11]，而云南省大理地區(qū)HPV感染相關(guān)的數(shù)據(jù)報(bào)道較少，因此對(duì)大理地區(qū)居民的HPV感染情況進(jìn)行研究。

HPV檢測(cè)包括HPV載量檢測(cè)和HPV分型檢測(cè)。在本研究中，利用13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了1587例患者病毒載量，陽性率為12.98%（206/1587）；而利用21型HPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了1325例患者的感染亞型，陽性率為18.57%（246/1325），如果排除13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒不能夠檢測(cè)的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）八種亞型外，陽性率為16.30%（216/1325），兩種檢測(cè)方法在檢出效率方面無差異（P > 0.05）。

國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，子宮頸癌的發(fā)病高峰為>35～39歲和>60～64歲[12-13]，而本研究結(jié)果提示：13種高危型HPV檢測(cè)的結(jié)果為≤20歲的感染率最高為50%（2/4），其次為>20～30歲年齡段的感染率19.02%（31/163），而21種HPV感染檢測(cè)中以>20～30歲的感染率最高38.66%（46/119），其次為>30～40歲年齡段的感染率19.51%（95/487），兩種檢測(cè)技術(shù)均顯示>20～30歲為高發(fā)年齡，與我國其他地區(qū)HPV感染的高發(fā)年齡相比，年齡偏低[14-16]。由于≤20歲年齡的患者較少，因此其感染率不能夠代表該地區(qū)該年齡段的感染情況。大理地區(qū)HPV感染的高發(fā)年齡與中國HPV感染的高峰年齡不完全一致，可能與該地區(qū)的地域差異有關(guān)。

利用21型HPV試劑盒對(duì)大理地區(qū)的人群的研究發(fā)現(xiàn)，高危亞型感染最多的是HPV16亞型，陽性率為29.67%（73/246），其次為HPV52亞型為21.14%（52/246）；低危亞型感染中，感染率最高的是HPV81亞型為6.10%（15/246），而中國人群最常見的HPV基因型為HPV16、53和CP8304，大理地區(qū)的HPV感染型別表現(xiàn)出一定的地域特點(diǎn)，該感染特點(diǎn)也與國內(nèi)的其他地區(qū)、以及與東南亞、南非等地的感染優(yōu)勢(shì)亞型不完全相同[4，5，12，13，15]。因此本研究說明HPV感染率的高低、以及不同地區(qū)HPV感染的型別具有一定的異質(zhì)性，其原因可能是病毒因素、宿主因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果[2，17-18]。因此在臨床治療以及疫苗研發(fā)和應(yīng)用上，針對(duì)臨床目的的不同，以選擇不同的取材方式、檢測(cè)方式及其亞型的分布[19-20]。

綜上所述，云南省大理地區(qū)13種高危亞型HPV的感染率、21種HPV的感染率以及兩種檢測(cè)方法所得到的各個(gè)年齡段的感染率均與其他地方基本相同；但是在21種HPV檢測(cè)得到的結(jié)果提示具有一定的特異性，因此在HPV檢測(cè)中兩種方法的選擇應(yīng)該以臨床的需要進(jìn)行選擇，抗病毒治療，那么需要得到病毒載量的改變情況，選擇13種高危型HPV檢測(cè)，如果需要進(jìn)行HPV疫苗治療，那么應(yīng)該選擇21種HPV檢測(cè)。

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