基因組編輯技術(shù)是指可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)改造的遺傳操作技術(shù)，其在基因功能研究和改造、生物醫(yī)學(xué)和植物遺傳改良等方面都具有重大的應(yīng)用價(jià)值。科學(xué)家自20世紀(jì)90年代末就開始探索基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的新突破和人工核酸內(nèi)切酶（EEN）技術(shù)的出現(xiàn)，將特異識(shí)別并結(jié)合DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域和EEN融合，創(chuàng)造出能夠特異切割DNA序列的核酸酶（SSNs），從而可以對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行高效和精確的靶向編輯。

圖1：SSNs介導(dǎo)的DSBs及其修復(fù)途徑

一、基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上的應(yīng)用進(jìn)展

目前，在作物遺傳改良上應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)三種類型。其中CRISPR/Cas系統(tǒng)包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2等亞類型，但應(yīng)用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚無在作物改良上應(yīng)用的報(bào)道。

上述三類基因組編輯技術(shù)均能對(duì)植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)的定點(diǎn)敲除、插入和替換，對(duì)于控制作物重要農(nóng)藝性狀基因的功能鑒定、作物重要性狀的遺傳改良具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)的常規(guī)育種相比，基因組編輯技術(shù)能直接對(duì)目標(biāo)性狀基因進(jìn)行修飾，大幅度提高了目標(biāo)性狀聚合的精準(zhǔn)度，加快了聚合育種的進(jìn)程。近年來，對(duì)該技術(shù)的優(yōu)化及在作物遺傳改良上的應(yīng)用已成為各國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)的重點(diǎn)。

（一）ZFNs技術(shù)及其應(yīng)用

ZFNs技術(shù)被稱為第一代基因組編輯技術(shù)，是一種人工改造而成的核酸內(nèi)切酶，由鋅指蛋白的DNA結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域組成。其中，DNA結(jié)合域通常由3-6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（Zincfingerdomain，ZFD）串聯(lián)而成。一個(gè)ZFD能特異識(shí)別DNA鏈上3個(gè)連續(xù)的核苷酸堿基，多個(gè)ZFD串聯(lián)后就能特異識(shí)別較長的核苷酸序列。近年來，ZFNs技術(shù)已成功應(yīng)用于人類干細(xì)胞、大鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、煙草和玉米等生物體的基因組編輯。但是ZFNs的構(gòu)建難度較大，普通分子實(shí)驗(yàn)室難以操作，且成本高。

（二）TALENs技術(shù)及其應(yīng)用

TALENs是繼ZFNs之后的第二代基因組編輯技術(shù)。TALEN的DNA結(jié)合域?yàn)樘烊坏幕蚪?jīng)改造的TAL效應(yīng)子（TALeffector，TALE）蛋白結(jié)構(gòu)域。TALE重復(fù)區(qū)的每個(gè)重復(fù)單元能特異識(shí)別一個(gè)特定的核甘酸堿基，多個(gè)重復(fù)單元串聯(lián)后就能特異識(shí)別較長的核苷酸序列。與ZFN相比，TALEN載體的構(gòu)建相對(duì)簡單、成本更低、普通的分子生物實(shí)驗(yàn)室也能操作。此外，TALEN技術(shù)基于重復(fù)單元與核苷酸堿基一對(duì)一的識(shí)別模式，特異性更強(qiáng)，靶向編輯的效率更高。

2012年，LI等首次利用TALENs技術(shù)對(duì)水稻白葉枯病感病基因Os11N3（SWEET14）啟動(dòng)子中的效應(yīng)蛋白結(jié)合元件（effector-bindingelement，EBE）進(jìn)行定點(diǎn)編輯，有效阻止了水稻白葉枯菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo）分泌的效應(yīng)蛋白（AvrXa7和PthXo3）與Os11N3啟動(dòng)子結(jié)合，使該基因不受Xoo的誘導(dǎo)表達(dá)，從而提高了水稻的白葉枯病抗性。2014年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)利用TALENs技術(shù)同時(shí)靶向突變小麥MLO，證明TALENs技術(shù)能對(duì)小麥這樣的多倍體植物進(jìn)行定向遺傳改良。

（三）CRISPR/Cas9技術(shù)及其應(yīng)用

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌抵御病毒和外源DNA入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為兩大類。第一大類由多個(gè)Cas蛋白組成的復(fù)合體行使生物學(xué)功能，第二大類由單個(gè)Cas蛋白（如Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2）行使生物學(xué)功能。CRISPR/Cas9屬于II類，僅需要成熟的crRNA（CRISPR-derivedRNA）、tracrRNA（trans-activatingRNA）和Cas9蛋白就能實(shí)現(xiàn)對(duì)外源DNA的切割。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單、編輯效率高、容易實(shí)現(xiàn)多基因編輯等優(yōu)勢，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行定向修飾，能不同程度地改良作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和株型等，是作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種的新途徑。此外，通過CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除作物抗性負(fù)調(diào)控因子基因，或定點(diǎn)修飾抗逆性正調(diào)控基因的啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的表達(dá)，或?qū)剐韵嚓P(guān)基因編碼區(qū)定點(diǎn)替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

LI等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻產(chǎn)量負(fù)調(diào)控基因Gn1a（每穗實(shí)粒數(shù)）、DEP1（直立型密穗）、GS3（粒長和粒重）和IPA1（穗粒數(shù)、分蘗相關(guān)）進(jìn)行定點(diǎn)修飾，發(fā)現(xiàn)Gn1a或DEP1、GS3突變后水稻的每穗實(shí)粒數(shù)或著粒密度、粒長都明顯增加，但DEP1突變體在著粒密度增加的同時(shí)有半矮化現(xiàn)象，而GS3突變體在粒長增加的同時(shí)芒也顯著增長。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所趙開軍團(tuán)隊(duì)以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsERF922，獲得的T2純合突變系在苗期和分蘗期對(duì)稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高。SHI等利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將玉米GOS2啟動(dòng)子定點(diǎn)插入ARGOS8的5′-非翻譯區(qū)或直接替換ARGOS8的啟動(dòng)子，獲得ARGOS8表達(dá)量顯著增加的突變體。這是目前首次報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)量來改良作物遺傳性狀的案例。2016年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院莊楚雄團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進(jìn)行特異性編輯，創(chuàng)制了一批溫敏核雄性不育系。

（四）CRISPR/Cpf1技術(shù)及其應(yīng)用

CRISPR/Cpf1隸屬于II類typeV-ACRISPR系統(tǒng)，是迄今發(fā)現(xiàn)最簡單、有效的II類CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cpf1特異切割DNA雙鏈的原理與CRISPR/Cas9相似，但其作用機(jī)制不同。Cpf1是Cas蛋白的一種，其功能與Cas9類似，目前AsCpf1（Acidaminococcussp.Cpf1），LbCpf1（LachnospiraceaebacteriumCpf1）和FnCpf1（FrancisellanovicidaCpf1）已被證實(shí)具有DNA切割及執(zhí)行RNA加工的活性。Cpf1蛋白由具有識(shí)別sgRNA功能的a-REC區(qū)域和具有核酸酶功能的NUC區(qū)域構(gòu)成。a-REC包含REC1和REC22個(gè)識(shí)別結(jié)構(gòu)域；NUC主要包含RuvC結(jié)構(gòu)域、WED（wedge）結(jié)構(gòu)域、一種推定的核酸酶（Nuc）結(jié)構(gòu)域和PI（PAM-interacting）結(jié)構(gòu)域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分別負(fù)責(zé)切割靶DNA的非互補(bǔ)鏈及互補(bǔ)鏈的不同位點(diǎn)，由此產(chǎn)生具粘性末端的DSBs。不同于SpCas9（StreptococcuspyogenesCas9），Cpf1僅需一個(gè)42-nt的crRNA（3′端有23-nt與靶DNA序列互補(bǔ)），就能對(duì)靶DNA雙鏈進(jìn)行切割。研究證明Cpf1核酸酶在人類細(xì)胞中與SpCas9具有相當(dāng)?shù)那懈钚?，也證實(shí)Cpf1核酸酶在人類細(xì)胞中具有高度的特異性。

目前，CRISPR/Cpf1技術(shù)已成功應(yīng)用于煙草、大豆和水稻的基因組編輯。XU等將LpCpf1分別與precrRNA和加長pre-crRNA融合構(gòu)建了crRNA-Cpf1系統(tǒng)，在水稻中的編輯效率最高可達(dá)41.2%。HU等將LpCpf1和crRNA整合開發(fā)了CRISPR-Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)水稻內(nèi)源基因的定點(diǎn)編輯。TANG等針對(duì)Cpf1蛋白及crRNA的表達(dá)特性，構(gòu)建了PolII型啟動(dòng)子融合核酶（ribozyme）驅(qū)動(dòng)的Cpf1和crRNA植物表達(dá)單元，并成功對(duì)水稻內(nèi)源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5進(jìn)行定點(diǎn)突變。WANG等將四個(gè)DR（directrepeats）-guide單元組成的crRNA分別與FnCpf1和LbCpf1融合構(gòu)建CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)簡單、高效地實(shí)現(xiàn)了水稻多基因定點(diǎn)編輯。

（五）利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方式上的技術(shù)創(chuàng)新

單堿基突變可引起作物許多農(nóng)藝性狀的改變，因此，實(shí)施單堿基編輯對(duì)作物遺傳改良具有十分重要的意義。2016年，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院朱健康團(tuán)隊(duì)將APOBEC1通過非結(jié)構(gòu)化的16殘基肽XTEN作為接頭，融合到Cas9（D10A）的N末端，并將核定位信號(hào)（NLS）肽添加到Cas9（D10A）的C末端，構(gòu)建了APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)對(duì)水稻NRT1.1B和SLR1進(jìn)行編輯，結(jié)果表明該系統(tǒng)能在靶位點(diǎn)產(chǎn)生預(yù)期的C→T（G→A）堿基替換，NRT1.1B和SLR1在靶位點(diǎn)產(chǎn)生預(yù)期突變的效率分別為2.7%和13.3%。

二、基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于作物改良的基本原則

（一）ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉擇

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術(shù)，但三者在設(shè)計(jì)、特異性和效率上各有不同。ZFNs由于特異性不高、脫靶問題嚴(yán)重及獲得ZFN蛋白非常困難，嚴(yán)重阻礙了其廣泛應(yīng)用。TALENs的優(yōu)點(diǎn)是特異高、脫靶效應(yīng)低，但載體構(gòu)建較繁瑣、編輯效率不是很高、且難以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯。CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是編輯效率非常高，設(shè)計(jì)和構(gòu)建極其簡單，但CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性稍差，存在較明顯的脫靶效應(yīng)，另受PAM識(shí)別位點(diǎn)限制。

（二）基因敲除還是基因替換？

目前，基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良主要有兩種方式，一是通過靶向敲除目標(biāo)性狀負(fù)調(diào)控基因，造成該基因功能缺失，以改良目標(biāo)性狀；二是通過對(duì)目標(biāo)性狀控制基因進(jìn)行定點(diǎn)替換，導(dǎo)致該基因功能發(fā)生改變，從而獲得新的目標(biāo)性狀。因此，在實(shí)踐中運(yùn)用基因組編輯技術(shù)對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良時(shí)也要分以下兩種情況：一是對(duì)于目標(biāo)性狀起負(fù)調(diào)控作用的基因采取基因敲除的方式，目前，絕大部分基于基因組編輯技術(shù)的作物遺傳改良都是通過此方式實(shí)現(xiàn)的，如水稻稻瘟病抗性的改良、水稻溫敏核雄性不育系的創(chuàng)制等；二是對(duì)于目標(biāo)性狀的獲得是因目標(biāo)基因突變導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變的基因，采用基因定點(diǎn)替換的方式，如抗除草劑水稻、玉米等都是通過基因定點(diǎn)替換而獲得的。

（三）靶位點(diǎn)如何選擇

在作物遺傳改良的實(shí)際操作中，是敲除多基因還是單基因、靶位點(diǎn)在基因上的位置及數(shù)目都是需要考慮的。如果需要同時(shí)改良多個(gè)目標(biāo)性狀，以及目標(biāo)性狀是由微效多基因或多等位基因控制的情況，最好針對(duì)每個(gè)目標(biāo)性狀控制基因，或微效多基因等設(shè)計(jì)多個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行定向敲除，能最快、最省地獲得改良目標(biāo)性狀。如果控制目標(biāo)性狀的是主效基因，則敲除單個(gè)基因一般即可達(dá)到改良目的。

靶位點(diǎn)在基因上的位置也比較重要，進(jìn)行基因敲除時(shí)，靶位點(diǎn)應(yīng)優(yōu)先選擇在起始密碼子附近，或在特定的功能域（可能引起密碼子缺失和移碼）；而如果是基因替換，靶位點(diǎn)則需選擇在基因特定功能區(qū)（突變后基因功能發(fā)生改變的區(qū)域）。此外，靶位點(diǎn)的數(shù)量也關(guān)系到定向編輯的效率和遺傳轉(zhuǎn)化的規(guī)模。

三、基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上應(yīng)用的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

基因組編輯技術(shù)從出現(xiàn)至今不過短短十多年時(shí)間，但其已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。特別是TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后，極大地加快了作物分子育種的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已成為基因編輯應(yīng)用的首選，廣泛應(yīng)用于生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良，主要是通過定點(diǎn)突變靶標(biāo)基因，造成基因功能缺失以實(shí)現(xiàn)性狀改良，故敲除的基因必須都是目標(biāo)性狀負(fù)調(diào)控基因。但作物許多性狀改良都需要獲得基因功能，因此，基因組定點(diǎn)替換或插入的基因組編輯具有更廣泛的應(yīng)用前景，而植物細(xì)胞中同源重組效率很低，目前植物基因組編輯技術(shù)對(duì)基因單堿基替換、片段定點(diǎn)插入和替換等編輯的效率還很低。因此，對(duì)大部分控制重要農(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因目前還無法高效、精準(zhǔn)地進(jìn)行編輯，極大地限制了基因編輯技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于作物遺傳改良的發(fā)展。

綜上所述，基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為作物分子育種提供了新的機(jī)遇，但仍然面臨政策法規(guī)和技術(shù)優(yōu)化兩方面的挑戰(zhàn)。在植物基因功能研究和作物遺傳改良方面，基因編輯技術(shù)具有其他分子技術(shù)無法比擬的巨大優(yōu)勢和機(jī)遇。隨著大量作物品種全基因組測序的完成和越來越多重要農(nóng)藝性狀不利基因被發(fā)現(xiàn)，基因組編輯技術(shù)必將在作物遺傳改良和品種培育上發(fā)揮巨大的作用。