趙艷芳 ，張 樂，王亞寧，寧 越，王洪寶,2，昝林森,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對食品營養(yǎng)價(jià)值的要求也越來越高。牛肉蛋白質(zhì)含量高而脂肪含量低，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，能提高機(jī)體抗病能力，并富含鐵、硒、鋅、銅、錳等礦物質(zhì)元素，故越來越受到我國消費(fèi)者的青睞，有“肉中驕子”的美譽(yù)[1-6]。但是隨著牛肉需求量的增大，市場牛肉供給不足，牛肉價(jià)格持續(xù)上漲，如何提高牛肉產(chǎn)量和改善牛肉品質(zhì)成為廣大牛育種工作者關(guān)注的熱點(diǎn)，對肉牛肌肉組織生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究將從分子水平揭示影響肉牛產(chǎn)肉性能和牛肉品質(zhì)形成的機(jī)理，為肉牛的分子育種工作奠定基礎(chǔ)。肌肉的生成受一系列蛋白調(diào)控，包括原致癌腫瘤蛋白1(Wnt1)、配對盒式蛋白3(Pax3)、配對盒式蛋白7(Pax7)和肌調(diào)節(jié)因子等[7-8]，其中Pax7調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞，當(dāng)肌衛(wèi)星細(xì)胞激活時，未成熟肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞將會增殖分化[9]；Pax3和Pax7影響MRF-4、生肌決定因子(Myogenic regulatory factor,MyoD)、生肌決定因子5(Myogenic regulatory factor 5,Myf5)和肌細(xì)胞生成素的表達(dá)，而MyoD和Myf5激活肌肉特有基因從而調(diào)節(jié)前體細(xì)胞分化成為肌細(xì)胞并形成肌管[10-14]。除了上述轉(zhuǎn)錄因子外，表觀遺傳調(diào)節(jié)也在肌生成轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，兩者相互作用從而在肌位點(diǎn)中形成一些重要的信號通路[15]。

RING1和YY1結(jié)合蛋白(Ring1 and YY1 binding protein,Rybp)又名死亡效應(yīng)相關(guān)因子(Death effector domain-associated factor,Dedaf)，是Garcia等[16]于1999年利用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠中篩選出的一個由228 個氨基酸殘基組成的具有鋅指結(jié)構(gòu)域的堿性蛋白質(zhì)。利用生物物理以及流體動力學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，自然狀態(tài)下Rybp處于非折疊狀態(tài)，當(dāng)與蛋白質(zhì)或DNA相互作用時其構(gòu)象發(fā)生改變，出現(xiàn)自身折疊現(xiàn)象[17]。Rybp能與PcG復(fù)合物中環(huán)指蛋白1(Ring finger protein 1,RING1)、YY1轉(zhuǎn)錄因子(YY1 transcription factor,YY1)及E2F家族轉(zhuǎn)錄因子E2F2 (Transcription factor 2,E2F2)和E2F3 (transcription factor 3,E2F3)等成員相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[18]。Rybp在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，在人淋巴組織和胎盤內(nèi)表達(dá)量最高[19]。Rybp生物學(xué)功能繁多，可與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)多個蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[18]。對模式動物果蠅和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Rybp在胚胎、眼及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著作用[20]。許多研究表明，Rybp與人類惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[18]。Rybp是多梳基因家族(PcG)中的一員，參與多梳蛋白抑制復(fù)合物(PRC1)的組成，并在抑制基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育以及調(diào)控表觀遺傳等方面發(fā)揮著重要作用[21]。

肌肉的生成是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程。研究表明，在肌生成的調(diào)控系統(tǒng)中，miRNA也扮演了一定的角色，其通過結(jié)合靶標(biāo)3′-UTR導(dǎo)致mRNA分裂和抑制翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控其靶基因，其中miRNA-29是促肌源性因子，可與轉(zhuǎn)錄因子YY1和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(EzH2)相互作用[22]。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子YY1被核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)激活后，聚集EZH2使miRNA-29轉(zhuǎn)錄沉默，從而抑制肌肉分化[23-24]。在miRNA-29全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)中，miRNA-29基因可通過與Rybp基因3′-UTR結(jié)合而調(diào)節(jié)Rybp基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此Rybp基因?yàn)閙iRNA-29基因的靶標(biāo)之一。功能研究表明，在體外C2C12細(xì)胞(小鼠成肌細(xì)胞)分化和體內(nèi)肌肉再生過程中，Rybp表達(dá)下調(diào)，對骨骼肌的生成起負(fù)調(diào)控作用[25]。此外，Rybp基因與YY1共同占據(jù)一些肌生成位點(diǎn)(肌肉生成相關(guān)基因)，其中包括了miRNA-29基因，使其表達(dá)沉默，從而構(gòu)成Rybp-miR-29反饋回路。Rybp基因過表達(dá)會在目標(biāo)位點(diǎn)增大EZH2的含量并促進(jìn)組蛋白H3K27的甲基化，這暗示Rybp基因可能會促進(jìn)多梳抑制復(fù)合物的補(bǔ)充及穩(wěn)定。以上研究結(jié)果表明，Rybp基因可通過與YY1基因共同作用使miRNA-29基因與其他肌生成位點(diǎn)沉默，從而在肌生成過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)器作用[25]。

雖然Rybp基因與骨骼肌生成的關(guān)系在小鼠上得到了一定的驗(yàn)證，但Rybp基因在農(nóng)業(yè)動物上的研究很少，仍需要人們進(jìn)行探索，挖掘其潛在的功能。本試驗(yàn)研究了Rybp基因在秦川牛16種組織的表達(dá)譜及在不同月齡肌肉、脂肪組織和不同分化階段肌細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在為Rybp基因在牛肌生成中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

秦川牛組織樣品來自西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心良種繁育場，樣品包括來自3頭24月齡牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、腹膜脂肪、心包脂肪、背最長肌、里脊、大腸、小腸、瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃和瓣胃及6,12,18,24和60月齡的肌肉、脂肪組織，組織樣品用液氮速凍后于-80 ℃保存待用。秦川牛成肌細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 秦川牛組織總RNA提取及cDNA合成

采用傳統(tǒng)的Tizol法提取牛各組織的總RNA。提取過程為：取少量組織樣于研缽中，加入液氮反復(fù)研磨；加入 500 μL Trizol，繼續(xù)研磨混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫放置15 min后4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清，按Tizol總體積1/5的量加入氯仿，劇烈振蕩15 s后室溫靜置5 min； 4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清加入等體積的異丙醇充分混勻后室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，4 ℃、8 000 r/min離心5 min；室溫干燥2～5 min；用適量RNase-free水溶解RNA，測定濃度后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用酶標(biāo)儀檢測所提取總RNA的純度及濃度，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以提取的RNA為模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)說明進(jìn)行cDNA的合成。

1.3 秦川牛成肌細(xì)胞RNA的提取及cDNA合成

將秦川牛成肌細(xì)胞復(fù)蘇后采用生長培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的F-12/DMEM)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%左右融合時使用分化培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)2%馬血清和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的F-12/DMEM)培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基，于分化第0,2,4,6,8,10天取細(xì)胞樣品，采用Trizol法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，重復(fù)3次。

1.4 Rybp基因?qū)崟r定量引物及候選內(nèi)參基因引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Rybp基因及4個候選內(nèi)參基因β肌動蛋白(β-actin,ACTB)、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-2-微球蛋白(Beta-2-microglobulin,B2M)的基因序列信息(GenBank分別為：XM_015468713.1、HM768303.1、NM_001034034.2、AF176811和XM_001251107.5)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物 (表1)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 所用內(nèi)參基因和Rybp基因及其引物序列Table 1 Primer sequences of reference genes and Rybp gene

1.5 qRT-PCR擴(kuò)增

qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA(30 ng/μL) 2 μL，正反向引物(均10 μmol/L)各0.4 μL，2×SYBR Premix ExTaqTM(5 U/μL)10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(10 μmol/L) 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL, 每個樣品技術(shù)重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。延伸階段收集信號，從60 ℃到95 ℃，采集熔解曲線熒光信號和達(dá)到峰值循環(huán)數(shù)Ct值。

1.6 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評價(jià)

對4個候選內(nèi)參基因的所有生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)得到的Ct值進(jìn)行分析，并通過2個穩(wěn)定性評估軟件(BestKeeper和NormFinder軟件)分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，表達(dá)穩(wěn)定值越小表示該內(nèi)參基因越穩(wěn)定。綜合分析以上2種方法的結(jié)果，確定最佳內(nèi)參基因。

1.7 Rybp基因在不同組織表達(dá)量的計(jì)算

利用ABI 7500實(shí)時熒光定量儀測定Rybp基因在16種組織、5個不同發(fā)育階段肌肉和脂肪組織以及不同分化階段牛成肌細(xì)胞中的表達(dá)量。以內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評價(jià)中穩(wěn)定性最好的基因?yàn)閮?nèi)參基因，計(jì)算相對表達(dá)量(Relative quantity,RQ)，計(jì)算公式如下：

RQ=2-[(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)]

式中：Ct1和Ct3分別為待測組和對照組目標(biāo)基因Ct均值；Ct2和Ct4分別為待測組和對照組內(nèi)參基因的Ct均值。

所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SD)”表示；用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物及Rybp基因?qū)崟r定量引物的特異性分析

以秦川牛不同組織的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。由圖1可見，4個內(nèi)參基因和Rybp基因溶解曲線都有很明顯的單一峰，不存在引物二聚體，說明通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)，可以滿足后續(xù)實(shí)時定量試驗(yàn)對引物的要求。

圖1 4個內(nèi)參基因和秦川牛Rybp基因的溶解曲線Fig.1 Melting curves of four reference genes and Rybp gene

2.2 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的評估

2.2.1 內(nèi)參基因在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的變化 由圖2可知，各內(nèi)參基因的表達(dá)水平在16種組織中存在一定差異，但在3個重復(fù)之間的變異都很小。這說明不同處理?xiàng)l件下內(nèi)參基因穩(wěn)定性不同。因此，在不同處理實(shí)時定量分析時，有必要確定一個適合的內(nèi)參基因來研究不同處理?xiàng)l件下某一基因表達(dá)時序的差異。

1～16.分別代表睪丸、脾、肺、肝、腹膜脂肪、大腸、腎、皺胃、瘤胃、心包脂肪、小腸、網(wǎng)胃、瓣胃、背最長肌、里脊和心組織。圖3同1-16.Testis,spleen,lung,liver,retroperitoneal fat,large intestine,kidney,abomasum,rumen,pericardial fat,small intestine,reticulum,omasum,LDM,tenderloin and heart.The same for Fig.3圖2 內(nèi)參基因不同組織中的峰值循環(huán)數(shù)Ct值Fig.2 Ct of four reference genes in different tissues

2.2.2 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評價(jià) 由表2可知，使用NormFinder軟件分析時，GAPDH、B2M、18S rRNA、β-actin的表達(dá)穩(wěn)定值分別為1.542，1.908，1.252和3.451，其表達(dá)穩(wěn)定性的順序?yàn)椋?8S rRNA>GAPDH>B2M>β-actin。使用BestKeeper軟件分析時，GAPDH、B2M、18S rRNA、β-actin的表達(dá)穩(wěn)定值分別為1.48，2.21，3.45和5.00，其表達(dá)穩(wěn)定性的順序?yàn)椋篏APDH>B2M>18S rRNA>β-actin。

表2 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析Table 2 Expression stability of 4 reference genes

由以上分析可知，NormFinder和BestKeeper軟件的分析結(jié)果具有一定的差異。NormFinder軟件分析結(jié)果顯示，18S rRNA基因的穩(wěn)定性最好，GAPDH基因緊隨其后;而BestKeeper軟件分析結(jié)果顯示，GAPDH基因的穩(wěn)定性最好，18S rRNA基因的穩(wěn)定性排第三，表達(dá)穩(wěn)定值與GAPDH基因相差甚遠(yuǎn)，且18S rRNA基因在不同組織中轉(zhuǎn)錄的Ct值多在10到20之間，與目標(biāo)基因相差較多，容易產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。綜合以上分析結(jié)果可知，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因效果最佳。

2.3 Rybp基因在秦川牛不同組織中的表達(dá)

由圖3可知，Rybp基因在秦川牛背最長肌、里脊、腹膜脂肪等16種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量在不同組織間存在顯著或極顯著差異，Rybp在腹膜脂肪、肝、脾、肺、睪丸中表達(dá)量較高，其中在睪丸中的表達(dá)量最高，是背最長肌的365倍，與其他組織的表達(dá)量有極顯著差異；在背最長肌、里脊、心臟中Rybp表達(dá)量較低，且差異不顯著。

圖注上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同

2.4 Rybp基因在不同月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中的表達(dá)

由圖4可知，Rybp基因在6，12，18，24，60月齡秦川牛肌肉組織中的表達(dá)量具有一定的差異，其中在6月齡肌肉組織中表達(dá)量最低，在60月齡肌肉組織中表達(dá)量最高，且極顯著高于其他月齡，是6月齡的7倍；在6，12，18，24月齡表達(dá)量呈微弱上升趨勢，但差異不顯著。該結(jié)果表明，隨著秦川牛月齡的增加，Rybp基因在肌肉中的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢。

圖4 Rybp基因在秦川牛不同月齡肌肉組織中的相對表達(dá)量Fig.4 Expression levels of Rybp cattle muscle tissues at different months

由圖5可知，Rybp基因在6，12，18，24，60月齡秦川牛脂肪組織中的表達(dá)量具有一定的差異，其中以6月齡脂肪組織中的表達(dá)量最高，60月齡脂肪組織中的表達(dá)量最低，在6，12，18，24月齡脂肪組織中的表達(dá)量分別是60月齡的8.5，6.5，5.6和2.1倍。Rybp基因在6月齡脂肪組織中的表達(dá)量極顯著高于其他月齡，在12，18月齡的表達(dá)量也極顯著高于24，60月齡，而12和18月齡及24和60月齡之間也有顯著差異。該結(jié)果表明，隨著秦川牛月齡的增加，Rybp基因在脂肪組織中的表達(dá)水平呈下降趨勢，尤其從18月齡到24月齡，Rybp基因表達(dá)量急劇下降。

2.5 Rybp基因在秦川牛不同分化階段成肌細(xì)胞中的表達(dá)

由圖6可知，Rybp基因在不同分化階段秦川牛成肌細(xì)胞中的表達(dá)量具有一定的差異，在第6天的表達(dá)量顯著高于第4，8和10天，且極顯著高于第0和2天，其中以第0天的表達(dá)量最低，第2，4，6，8，10天成肌細(xì)胞中的表達(dá)量分別是第0天的3.6，5.0，9.9，7.0和4.3倍，可見隨著分化時間的延長，Rybp基因表達(dá)量先增加后降低。

由圖7可知，隨著分化培養(yǎng)時間的增加，秦川牛成肌細(xì)胞肌管形成數(shù)量增加，在第6天時肌管數(shù)量達(dá)到頂峰，而繼續(xù)培養(yǎng)到第8，10天時，肌管數(shù)量下降但長度增加，表明秦川牛成肌細(xì)胞從第0～6天分化能力逐漸增強(qiáng)，之后分化能力減弱，這一變化趨勢與Rybp基因在秦川牛成肌細(xì)胞不同分化階段的表

達(dá)量的變化趨勢相吻合，表明隨著秦川牛成肌細(xì)胞分化增強(qiáng)，Rybp基因表達(dá)量逐漸增加。

圖6 Rybp基因在秦川牛不同分化階段成肌細(xì)胞中的相對表達(dá)量Fig.6 Expression levels of Rybp at different myogenic differentiation stages

A-F分別為分化第0,2,4,6,8和10天的成肌細(xì)胞A-F are the 2,4,6,8 and 10 days of muscle cells differentiation.圖7 不同分化階段秦川牛成肌細(xì)胞的分化情況 (40×)Fig.7 Morphologic change of myoblast at different differentiation stages (40×)

3 討 論

Rybp基因作為多梳(PcG)家族的一員，被證明是MicRNA-29新的靶基因。通過更深入的研究發(fā)現(xiàn)，Rybp基因負(fù)調(diào)控骨骼肌生成，并與YY1基因共同作用[25]。Rybp基因與YY1基因共同占據(jù)包括miR-29在內(nèi)的啟動子和增強(qiáng)子位點(diǎn)，從而使其在成肌細(xì)胞形成過程中保持沉默，進(jìn)而形成反饋回路。本試驗(yàn)通過一系列實(shí)時定量PCR，著重研究了Rybp基因在秦川牛各個組織、不同月齡肌肉組織和脂肪組織及秦川牛成肌細(xì)胞不同分化階段的表達(dá)情況，為進(jìn)一步分析Rybp基因在秦川牛肌肉生成過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

在本研究中，Rybp基因在24月齡秦川牛不同組織中的表達(dá)存在顯著差異，其中在脾、肺、睪丸中的表達(dá)量較高，在背最長肌、里脊、心組織中的表達(dá)量較低，而且在睪丸組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織，這與對家蠶5齡3 d(第4次脫皮第3天)幼蟲的研究[26]相一致，由此推測Rybp基因可能對牛的繁殖性能有一定作用。而Rybp基因在肌肉組織中的表達(dá)量明顯低于其他組織，其原因值得進(jìn)一步探索。Zhou等[25]對小鼠的研究表明，Rybp基因在小鼠肺中表達(dá)量最高，在骨骼肌中表達(dá)量最低，這一結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。Zhou等[25]還指出，雖然Rybp基因在小鼠成熟骨骼肌中表達(dá)較少，但是Rybp基因與YY1基因共同高度富集在新形成的獨(dú)立成肌細(xì)胞周圍，這也一定程度上暗示其在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞生長分化中的作用。

根據(jù)本研究結(jié)果，筆者推測Rybp基因可能在牛肌肉生成過程中具有抑制作用。針對Rybp基因關(guān)于肌肉生成方面的作用，本試驗(yàn)還檢測了Rybp基因在秦川牛不同月齡肌肉組織、脂肪組織和不同分化階段秦川牛成肌細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Rybp基因在6,12,18,24和60月齡秦川牛肌肉組織中的相對表達(dá)量逐漸增高，在6，12，18，24和60月齡秦川牛脂肪組織中的轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，印證了24月齡秦川牛各組織中Rybp基因的相對表達(dá)量表現(xiàn)為脂肪組織高于肌肉組織。在牛肌肉組織中，Rybp基因表達(dá)量隨著秦川牛的生長發(fā)育而逐漸增加，而6，12，18和24月齡的秦川牛正值生長期，肌肉生長速率快，而24月齡之后秦川牛肌肉的生長速率下降，肌肉積累速率變慢，表明Rybp基因表達(dá)量的增加可能抑制了秦川牛肌肉的積累。在秦川牛成肌細(xì)胞分化的不同階段，成肌細(xì)胞從第0～6天分化的肌管數(shù)量逐漸增加，第6天后肌管數(shù)量不再增加反而減少，但長度增長，而Rybp基因表達(dá)量在第0～6天逐漸增加，于第6天達(dá)到表達(dá)量峰值，從第6天開始Rybp基因表達(dá)量逐漸下降，可以看出，當(dāng)Rybp基因表達(dá)量達(dá)到峰值時，秦川牛成肌細(xì)胞分化減緩甚至不再分化。以上結(jié)果在一定程度表明，Rybp基因可能抑制牛的肌生成過程，若能確定Rybp基因?qū)ε＜∩傻囊种谱饔貌⒔沂酒渥饔脵C(jī)制，則可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解除Rybp基因?qū)∪馍L發(fā)育的抑制，即可達(dá)到加快肉牛生長速度、提高產(chǎn)肉量的育種目標(biāo)。

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