李守湖，范玉鋒，高 欣，李寶玉，吳鵬程，胡永浩，柳紀省

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2 蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730050;3 蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 蘭州 730020)

傳染性造血器官壞死癥(infectious hematopoietic necrosis，IHN)是一種以引起鮭鱒魚類腎臟和脾臟造血組織壞死為主要特征的高度接觸性傳染病[1-4]。IHN主要危害魚苗和種魚，發(fā)病魚死亡率通常在90%以上，是魚類口岸第一類檢疫對象，被我國列為二類動物疫病[5]。IHN給北美、歐洲和亞洲等各國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了毀滅性的打擊，嚴重阻礙了各國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[6-10]。我國于1990年在遼寧暴發(fā)IHN，死亡率近100%[5]。近年來，我國養(yǎng)鱒業(yè)發(fā)展迅速，因此深入研究IHN病原對于更好地防控此病具有重要的現(xiàn)實意義。其病原為傳染性造血器官壞死癥病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，是一種負鏈RNA病毒，隸屬彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬。IHNV長度約為11 kb，共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白和1種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白、磷酸化蛋白、基質(zhì)蛋白、表面糖蛋白、聚合酶蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中表面糖蛋白(G)可誘導中和抗體的產(chǎn)生，通常用于IHNV DNA疫苗的研究[11-14]。

重組腺病毒載體作為一種宿主廣泛、易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)導效率高以及繁殖滴度高的理想基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，常被用于基因工程疫苗的接種、基因的轉(zhuǎn)移等。在動物機體內(nèi)外，可以通過構(gòu)建重組腺病毒將特異性的外源靶基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞系[15-16]，進而獲得高效目標蛋白[17]，刺激機體產(chǎn)生強烈的體液和細胞免疫反應，是轉(zhuǎn)導目的基因的理想工具之一[18]。本試驗克隆了IHNVG基因，以腺病毒作為目的基因轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建表達IHNV G蛋白的重組腺病毒載體，旨在為IHN的預防及疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒與細胞系 IHN陽性病料(腎臟、脾臟)，采集自甘肅省永登縣某虹鱒魚養(yǎng)殖場；HEK-293細胞系，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物病毒病團隊提供。

1.1.2 質(zhì)粒與感受態(tài)細胞 Pad-Track-CMV穿梭載體、pAd-easy-1骨架載體、DH5α感受態(tài)細胞、DH10B感受態(tài)細胞和BJ5183感受態(tài)細胞，均購自武漢金開瑞生物科技有限公司。

1.1.3 試 劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Quick-Fusion快速克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶，均購自美國紐英倫生物技術(shù)(NEB)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自德國羅氏公司(Roche)；脂質(zhì)體2000，購自美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)。其他化學試劑均購自美國SIGMA 生物科技有限公司。

1.2 IHNV G基因的擴增與RT-PCR

根據(jù)GenBank上發(fā)表的IHNVG基因序列(GenBank登錄號：U50401.1)，應用DNA Star設(shè)計G基因特異性引物，上游引物增加了同源序列和SalⅠ酶切位點：5′-ATCTCTAGACCATGGGTCGACGCCACCATGTACACCATG-3′，下游引物增加了同源序列和XhoⅠ酶切位點： 5′-TAGATCTTCGAATCCCTCGAGTTAGGACCGGTTTGCCAG-3′，序列中下劃線部分為相應的酶切位點。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，預期擴增序列長度為1 533 bp。

按照RNA提取試劑盒說明書提取IHN病料總RNA，以提取的RNA為模板，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應體系20 μL：1 μg總RNA，2.5 μmol/L anchored-oligo(dT)18引物，10 U反轉(zhuǎn)錄酶，1×反轉(zhuǎn)錄酶buffer，20 U蛋白酶抑制劑，1 mmol/L脫氧核苷酸混合物，加ddH2O至總體系為20 μL；反應條件：65 ℃ 10 min，55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：cDNA模板2 μL，GXL DNA聚合酶(1.25 U/μL)1 μL，5×GXL DNA buffer 10 μL，dNTP Mixture(200 μmol/L)4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，加ddH2O至50 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共31個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時設(shè)置空體系對照。PCR產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 G基因的快速克隆和腺病毒載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物電泳鑒定后切下目的片段，按照DNA膠回收試劑盒說明書回收和純化目的片段，用SalⅠ和XhoⅠ雙酶切腺病毒載體Pad-Track-CMV使之線性化。按照快速克隆試劑盒說明書，G基因的快速克隆體系為：PCR產(chǎn)物 40 ng，Pad-Track-CMV載體20 ng，1.0 μL快速克隆酶，10×快速克隆酶2.0 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：37 ℃水浴鍋孵育30 min。反應結(jié)束后立即將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取白色菌落培養(yǎng)后進行PCR鑒定，同時設(shè)空載體對照。對陽性培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用SalⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質(zhì)粒立即送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行同源性比對。

1.4 Pad-Track-CMV載體與pAd-easy-1骨架載體的同源重組

將pAd-easy-1骨架載體轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細胞中，之后將帶有pAd-easy-1骨架載體的BJ5183大腸桿菌細胞做成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將1.3中鑒定合適的帶有目的基因的腺病毒載體Pad-Track-CMV用PmeⅠ酶切線性化后，按照膠回收試劑盒說明書回收產(chǎn)物，再將10 μL線性化的重組腺病毒載體(1 μg)與40 μL 含有pAd-easy-1骨架載體的BJ5183電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞置于直徑為2.0 mm的電轉(zhuǎn)杯中進行電擊。電擊條件為：電壓2 500 V，電阻200 Ω，電容25 μF，電擊時間5 ms。將電擊后的腺病毒重組質(zhì)粒按照100，200，300，400 μL分別涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h。挑取培養(yǎng)平板上培養(yǎng)的較小菌落，提取質(zhì)粒并進行PCR擴增，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，對疑似陽性的質(zhì)粒再用PacⅠ酶切鑒定，酶切體系為：1 μL限制性內(nèi)切酶PacⅠ、5 μL 10×buffer、1 μg重組質(zhì)粒，加ddH2O至50 μL；37 ℃作用4 h并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

通過與上述中相同的電擊條件，將陽性重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH10B中，以獲得高表達的重組質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切鑒定。然后從大腸桿菌DH10B中大量提取重組腺病毒質(zhì)粒，用PacⅠ消化以切除ori和卡那霉素抗性原件。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細胞

轉(zhuǎn)染前24 h將HEK-293細胞以1.0×106mL-1的密度分散于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將4 μg線性化重組質(zhì)粒DNA加入460 μL F12-DMEM中制成懸浮液A，將20 μL脂質(zhì)體2000加入到480 μL F12-DMEM中混勻制成懸浮液B，再將懸浮液A與懸浮液B混勻加入到培養(yǎng)好(匯合度達50%～70%)的HEK-293細胞中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，補加細胞培養(yǎng)液后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染8 d后，通過監(jiān)測綠色熒光蛋白(GFP)來確定轉(zhuǎn)染的結(jié)果，待細胞出現(xiàn)綠色熒光時，棄去上層5 mL細胞培養(yǎng)液并收集下層培養(yǎng)液5 mL，收集的病毒液反復凍融2次后，在HEK-293細胞中復制，復制5代后對重組病毒中的糖蛋白進行Western-blot檢測。

1.6 重組腺病毒糖蛋白表達的Western-blot檢測

收集上述重組病毒液樣品，同時取空白HEK-293細胞，加入RIPA蛋白裂解液于冰上裂解5 min，收集到EP管后進行超聲破碎(40 W 3 s，間隔3 s，重復20次)，然后于4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清，加入蛋白上樣緩沖液， 95 ℃作用10 min，制備樣品。將蛋白樣品加入SDS-PAGE孔中進行電泳，電泳條件：先在60 V電壓下反應60 min，再將電壓調(diào)到120 V直至結(jié)束。參考蛋白分子質(zhì)量標準將電泳結(jié)束后的凝膠切下，以β-actin為內(nèi)參，用PVDF膜進行200 mA 120 min的轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用50 g/L的牛血清白蛋白封閉1 h，用PBST洗3次，每次10 min；于封閉好的膜上加入1∶2 000倍稀釋好的兔抗IgG孵育1 h，用PBST洗3次，每次10 min；小心取出膜置于稀釋好的羊抗兔二抗中孵育2 h，用PBST洗3次，每次10 min，之后加入配好的顯色液進行化學發(fā)光反應。

1.7 重組腺病毒半數(shù)組織細胞感染量(TCID50)的測定

將復制10代后收集的病毒按照10-1～10-12連續(xù)稀釋成12個梯度，然后將稀釋的病毒接種在培養(yǎng)好HEK-293細胞的96孔板中，每個稀釋度重復8孔，每孔接種100 μL。每天觀察細胞病變情況并記錄結(jié)果，按照Reed-Muench法[19]計算病毒TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHNV G基因的PCR擴增

將IHNVG基因的PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，獲得了長1 533 bp的片段(圖1)，與預期片段長度相符。

1.5 000 bp DNA Marker；2.G基因；3.空白對照1.5 000 bp DNA Marker；2.G gene；3.Blank control圖1 IHNV G基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification product of IHNV with G gene

2.2 IHNV G基因重組載體Pad-Track-CMV的鑒定

IHNVG基因的重組腺病毒載體經(jīng)PCR鑒定獲得了1 533 bp的片段，經(jīng)SalⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定獲得了1 533 bp和9 200 bp的片段(圖2)，均與預期結(jié)果一致。測序分析結(jié)果顯示，本試驗中G基因的開放閱讀框(ORF)與IHNV ChYU78、ChAb76、KoMo71、RtNaq82和HV7601株的同源性為99%。結(jié)果表明，重組腺病毒載體Pad-Track-CMV構(gòu)建成功。

1.5 000 bp DNA Marker；2,4,6.SalⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物;3,5.空載體PCR擴增產(chǎn)物；7.重組腺病毒載體PCR擴增產(chǎn)物1.5 000 bp DNA Marker；2,4,6.Products of recombinant plasmids by SalⅠand XhoⅠ；3,5.PCR amplification product of empty vector；7.PCR amplification products of recombinant plasmid 圖2 IHNV G基因重組載體Pad-Track-CMV的PCR和SalⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant Pad-Track-CMV vector by PCR and double digestionplasmids with Sal Ⅰ/Xho Ⅰ

2.3 IHNV G基因重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定

重組腺病毒質(zhì)粒的PCR擴增和PacⅠ限制性內(nèi)切酶的消化結(jié)果(圖3)表明，PCR擴增獲得了1 533 bp的片段，符合預期；PacⅠ內(nèi)切酶消化獲得了長約33和4.5 kb的2條清晰條帶，與試驗預期結(jié)果相符。由此得知重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.G基因PCR擴增；2.內(nèi)切酶PacⅠ消化結(jié)果;3.5 000 bp DNA Marker1.PCR amplification of G gene;2.Recombinant plasmids by PacⅠ;3.5 000 bp DNA Marker圖3 IHNV G基因重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定Fig.3 Screening of recombinant adenovirus vector of IHNV with G gene

2.4 重組腺病毒糖蛋白表達的Western-blot

轉(zhuǎn)染的重組腺病毒經(jīng)HEK-293細胞復制5代后，以β-actin為內(nèi)參，通過Western-blot分析糖蛋白表達情況，結(jié)果(圖4)顯示，相比空白HEK-293細胞，重組腺病毒在分子質(zhì)量約58 ku處有蛋白條帶，表明轉(zhuǎn)染的重組腺病毒中糖蛋白能夠表達。

1,2,3.重組腺病毒糖蛋白；4.空白HEK-293細胞1,2,3.Expression of glycoprotein of the recombinant adenovirus;4.HEK-293 cells圖4 重組腺病毒糖蛋白表達的Western-blot分析Fig.4 Western-blot analysis on expression of glycoprotein of the recombinant adenovirus

2.5 重組腺病毒的TCID50

轉(zhuǎn)染重組腺病毒的HEK-293細胞第5 天時出現(xiàn)綠色熒光蛋白，第8天時有80%的細胞可以清楚觀察到綠色熒光蛋白(圖5)。根據(jù)Reed-Muench方法計算得知，重組腺病毒的TCID50為1.0×1010.4mL-1。

圖5 重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細胞第8天后GFP的表達Fig.5 Expression GFP of the recombinant adenovirus 8 days after transfecting

3 討 論

傳染性造血器官壞死癥(IHN)是一種主要危害鮭鱒魚的病毒性疫病，其引發(fā)的極高死亡率給國內(nèi)外冷水魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[20-21]。我國自1990年遼寧發(fā)現(xiàn)IHN以來，該病的傳播范圍不斷擴大。另外，我國對于IHN的研究相對落后，該病爆發(fā)基本無法控制，因此給鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的影響。疫苗免疫是目前防控該病的主要措施[22]，因此研制IHN疫苗成為我國防控該病的重中之重。表面糖蛋白能夠誘導中和抗體產(chǎn)生并刺激細胞免疫，在免疫保護機制中起著重要作用[23]。Kurath等[22]構(gòu)建了IHNV pIHNw-G DNA疫苗，用其免疫虹鱒魚苗3個月后可以檢出中和抗體。本試驗利用糖蛋白構(gòu)建了重組腺病毒載體，通過測序分析得知，IHNV的G基因仍保留著關(guān)鍵抗原位點，未發(fā)生關(guān)鍵內(nèi)氨基酸的突變。

重組腺病毒具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且不會整合到宿主基因組中，是用于動物體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染疫病靶基因的有效病毒載體之一。重組腺病毒在E3和E4中的突變，使得其與靶基因組可以通過包裝病毒在HEK-293細胞中轉(zhuǎn)染，由于轉(zhuǎn)染高效、宿主廣泛和病毒滴度較高，因此重組腺病毒載體被廣泛應用于疫苗的研發(fā)[24-25]。與傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)相比，重組腺病毒良好的免疫原性及安全性，促使其廣泛地成為建立疫苗平臺的理想基因轉(zhuǎn)移載體[26-27]。本研究首先運用快速克隆方法將IHNVG基因快速插入到Pad-Track-CMV載體中，代替了傳統(tǒng)依靠T載體連接目的基因的復雜操作，提高了載體的構(gòu)建效率。此外，同源重組在大腸桿菌內(nèi)進行，比傳統(tǒng)的細胞內(nèi)重組效率更高，使得陽性質(zhì)粒的篩選更為簡便[28]。本研究首先用化學方法將pAd-easy-1骨架載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞中，再將帶有目的基因的腺病毒載體電轉(zhuǎn)入感受態(tài)pAd easy-BJ5183中進行同源重組，相比于雙質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞更為簡便，顯著提高了重組效率。另外，利用Pad-Track-CMV載體攜帶的GFP可直接觀察到目的蛋白在細胞內(nèi)的表達情況，使得觀察轉(zhuǎn)染成功與否更為簡便。

綜上所述，本研究利用重組腺病毒系統(tǒng)，通過在大腸桿菌中同源重組，成功構(gòu)建了帶有IHNVG基因的重組腺病毒，轉(zhuǎn)染HEK-293細胞后，重組腺病毒能高效表達，且病毒滴度較高。糖蛋白在細胞中的高效表達，增加了魚類免疫應答和體內(nèi)抗體的產(chǎn)生可能，為研制IHN的針對性疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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