付海鈺 秦福恩 徐帥 楊淋 鐘祖凌 鞏固

[摘要] 目的 探討異氟烷（Iso）在缺氧/復(fù)氧（A/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的影響及其作用機(jī)制。 方法 培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2，用不同濃度的Iso（1%、2%、3%）預(yù)處理后進(jìn)行3 h的缺氧和3 h的復(fù)氧。MTT檢測細(xì)胞生長，篩選Iso使用濃度，隨后實時定量PCR檢測miR-499表達(dá)。在3% Iso預(yù)處理的A/R損傷心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-499的過表達(dá)試劑miR-499 mimic，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)；試劑盒檢測細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的含量。 結(jié)果 與Control組比較，A/R組的細(xì)胞活力顯著下降（P < 0.05），同時Iso預(yù)處理劑量依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞活力增加，由而篩選出3%作為Iso預(yù)處理濃度。與Control組比較，miR-499的表達(dá)在A/R組中顯著提升（P < 0.05），并在3% Iso預(yù)處理心肌細(xì)胞（Iso組）中下降（P < 0.05）。與Control組比較，A/R組的細(xì)胞生長顯著降低（P < 0.05），細(xì)胞凋亡升高（P < 0.05），促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax表達(dá)升高（P < 0.05），抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低（P < 0.05），LDH、CK和ALT的含量明顯升高（P < 0.05）。Iso預(yù)處理抑制以上由A/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷，并且此心肌細(xì)胞保護(hù)作用可被miR-499過表達(dá)反轉(zhuǎn)。 結(jié)論 Iso可以通過抑制miR-499表達(dá)減輕A/R引起的心肌細(xì)胞損傷。

[關(guān)鍵詞] 異氟烷；miR-499；心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧

[中圖分類號] R972 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0009-06

Effect of Isoflurane on anoxia/reoxygenation-induced cardiocyte injury

FU Haiyu QIN Fuen XU Shuai YANG Lin ZHONG Zuling GONG Gu

Department of Anesthesiology， General Hospital of Chengdu Military Region of PLA， Sichuan Province， Chengdu 610083， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Isoflurane （Iso） on anoxia/reoxygenation （A/R）-induced cardiocyte injury and underlying mechanism. Methods Cultured cardiocytes （H9c2） were pre-treated with Iso （1%， 2%， 3%） and then stimulated with 3 h of anoxia and 3 h of reoxygenation. Cell proliferation was measured by MTT method， and the Iso concentration was selected. The miR-499 overexpression reagent， miR-499 mimic was transfected into cardiocytes pre-treated with 3% Iso and simulated with anoxia/reoxygenation. Cell apoptosis was detected by flow cytometry assay. The expression level of caspase-3， caspase-9， Bax and Bcl-2 were measured by Western blot. The contents of lactic dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK） and alanine aminotransferase （ALT） were detected by corresponding kit， respectively. Results Compared with the control group， cell proliferation was significantly decreased in A/R group （P < 0.05）， and increased dose-dependently in Iso pre-treated cells （P < 0.05）， thus 3% was selected to be the concentration of Iso pre-treatment. Compared with the control group， the expression of miR-499 was significantly increased in A/R group （P < 0.05）， and decreased in 3% Iso treated cells （P < 0.05）. Compared with the control group， cell proliferation was significantly decreased （P < 0.05）； cell apoptosis was increased （P < 0.05）； the expression of pro-apoptotic protein caspase-3， caspase-9 and Bax were increased （P < 0.05）， anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased （P < 0.05）； the content of LDH， CK and AST were increased in A/R group （P < 0.05）. Iso pre-treat inhibited A/R induced H9c2 injury， and the protective effect of Iso was reversed by miR-499 overexpression in damaged cardiocyte. Conclusion Isoflurane attenuates anoxia/reoxygenation-induced cardiocyte injury through inhibiting miR-499 expression.

[Key words] Isoflurane； miR-499； Cardiocyte； Anoxia/reoxygenation

目前，心腦血管疾病已成為我國僅次于惡性腫瘤的第二殺手[1-2]。心肌細(xì)胞損傷是參與多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[3-4]。心肌缺血/再灌注損傷（I/RI）一直是心血管疾病的研究熱點問題[5]。心肌的持續(xù)性缺血會導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡以及組織損傷，早期的再灌注可以減輕心肌缺血所引起的心肌損傷，但在大量的臨床以及動物實驗觀察中發(fā)現(xiàn)，血流的再灌注在改善心肌供血的同時會加重心肌缺血所造成的損傷，引起心律失常、心室收縮功能降低以及心肌梗死等[6]。病理變化上缺血/再灌注可能引起心肌細(xì)胞水腫、細(xì)胞器膜以及細(xì)胞膜完整性的破壞、心肌纖維斷裂、微血管損傷等[7]。因此I/RI是影響心血管疾病患者心臟結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的主要因素之一。缺氧/復(fù)氧（anoxia/reoxygenation，A/R）誘導(dǎo)的心肌損傷模型常用來在細(xì)胞水平上模擬I/RI[8]。在心血管疾病的臨床治療中，有成千上萬的患者需要在術(shù)中接受全身麻醉。在體內(nèi)和體外的研究表明，多種麻醉劑可以通過抵抗A/R抑制心肌的損傷[9]。異氟烷是臨床上常用的揮發(fā)性麻醉劑之一。已有研究報道，異氟烷預(yù)處理可以保護(hù)心腦血管術(shù)后損傷，然而其保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未研究清楚[10]。MicroRNA（miRNA）參與到心肌缺血與再灌注引起的心血管損傷中多個環(huán)節(jié)的調(diào)控，影響并沉默多個相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[11]。最近有研究表明，在接受揮發(fā)性麻醉劑七氟烷麻醉的心血管病患中，miR-499的表達(dá)較低，表明miR-499可能參與麻醉劑預(yù)處理對心肌損傷的保護(hù)作用[12]。本研究以A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞為研究對象，探討異氟烷對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其與miR-499的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 心肌細(xì)胞A/R模型的建立

心肌細(xì)胞H9c2購于美國模式培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection，ATCC），培養(yǎng)于混合10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（HyClone公司）中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%融合狀態(tài)后傳達(dá)，取對數(shù)期生長狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行隨后實驗。心肌細(xì)胞的A/R模型通過以下方法來構(gòu)建：棄去原有培養(yǎng)液后，H9c2細(xì)胞中加入預(yù)充95%N2+5%CO2的缺氧液，并置于含有95%N2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)3 h，再將缺氧的細(xì)胞換用預(yù)充95%O2+5%CO2的含糖復(fù)氧液，并置于含有95%N2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)3 h。

1.2 細(xì)胞分組

異氟烷篩選實驗分為五組：Control組為正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞；A/R組細(xì)胞經(jīng)過3 h缺氧和3 h復(fù)氧處理；異氟烷處理組（以下簡稱“Iso組”）細(xì)胞分別經(jīng)過1%、2%和3%濃度異氟烷（Baxter公司，批號：088008）預(yù)處理30 min后，進(jìn)行3 h缺氧和3 h復(fù)氧處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗用LipofectamineTM-3000，按試劑盒說明進(jìn)行。異氟烷+miR-499 inhibitor組在加入3%異氟烷預(yù)處理的同時轉(zhuǎn)染20 μmol/L miR-499 inhibitor（上海吉凱基因），再進(jìn)行A/R處理；異氟烷+inhibitor control組在加入3%異氟烷預(yù)處理的同時轉(zhuǎn)染20 μmol/L inhibitor control，再進(jìn)行A/R處理。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞分組處理后用MTT法檢測其細(xì)胞活力。各組H9c2細(xì)胞以6×104個/孔，接種于96孔板，并且每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)液后每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，置于37℃培養(yǎng)4 h。棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀上檢測各組細(xì)胞吸光度值A(chǔ)490，并計算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=處理組A490/Control組A490×100%。

1.4 實時定量PCR法檢測miR-499表達(dá)變化。

采用常規(guī)的Trizol法提取心肌細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為：SYBR Green Mix 9 μL；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL；Forward primer 2 μL；Reverse primier 2 μL；加水至總體積20 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，35個循環(huán)；72℃延伸1 min。以U6 snRNA為內(nèi)參照，實驗結(jié)果miR-499和U6產(chǎn)物倍數(shù)按2-ΔΔCt計算。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡

AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD公司。心肌細(xì)胞分組處理后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，隨后加入含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化并且收集細(xì)胞。加入1×annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液1 mL，800 r/min離心8 min后棄去上清，加入結(jié)合緩沖液200 μL重懸細(xì)胞。并在懸液中加入5 mg/L的annexin V-FITC 10 μL以及PI 5 μL，混勻后37℃避光孵育30 min。最后以激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測蛋白水平

心肌細(xì)胞分組處理后，加入RIPA細(xì)胞蛋白裂解液65 μL，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入1∶1000稀釋的山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、和GAPDH的Ⅰ抗，4℃環(huán)境輕搖過夜。過夜后加入1∶100比例稀釋的HRP-標(biāo)記的兔抗山羊Ⅱ抗（Pierce公司），室溫下孵育1 h，漂洗3次；最后結(jié)果用X線膠片曝光分析，Image-Pro Plus軟件處理，以待測蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 生化指標(biāo)測定

細(xì)胞分組培養(yǎng)后取培養(yǎng)液上清，按各自檢測試劑盒操作說明步驟，測定乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的含量（南京建成生物工程研究所）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法進(jìn)行，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異氟烷預(yù)處理提升A/R的心肌細(xì)胞活力

用不同濃度的異氟烷（1%、2%、3%）預(yù)處理心肌細(xì)胞后，進(jìn)行A/R實驗，MTT法檢測異氟烷對細(xì)胞活力的影響。如圖1所示，與Control組比較，A/R組的細(xì)胞活力顯著降低（P < 0.05）。在加入異氟烷預(yù)處理的細(xì)胞中，細(xì)胞活力上升，并且異氟烷能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞活力的增加（P < 0.05）。因此，在后續(xù)實驗中選取3%作為異氟烷的處理濃度。

2.2 3%異氟烷抑制A/R心肌細(xì)胞中miR-499表達(dá)

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，A/R組的miR-499表達(dá)水平是Control組的（5.6±0.8）倍（P < 0.05），這表明A/R上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-499的表達(dá)。加入3%異氟烷預(yù)處理后，miR-499的表達(dá)與A/R組相比明顯降低（P < 0.05），表明異氟烷對A/R引起的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與miR-499有關(guān)。見圖2。

2.3 過表達(dá)miR-499降低3%異氟烷處理的A/R心肌細(xì)胞活力

如圖3A所示，實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與3% Iso組比較，加入miR-499 mimic轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中miR-499的表達(dá)顯著增高（P < 0.05），表明miR-499 mimic成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。MTT檢測心肌細(xì)胞活力，結(jié)果如圖3B所示，與Iso組比較，Iso+miR-499 mimic組的細(xì)胞活力明顯降低（P < 0.05）。

2.4 抑制miR-499提升異氟烷處理的A/R心肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖4所示，與Control組比較，A/R組的細(xì)胞凋亡明顯升高；并且與A/R組比較，3%異氟烷處理的細(xì)胞凋亡顯著降低（P < 0.05）。與Iso組比較，Iso+miR-499 mimic組的細(xì)胞凋亡明顯升高（P < 0.05）。Western blot法檢測促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax以及抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示Caspase-3、Caspase-9、Bax在A/R組中比Control組顯著增加，Iso組中下降，并在加入miR-499 mimic轉(zhuǎn)染后明顯提升。與之相反，Bcl-2在A/R組中比Control組降低，異氟烷中上升，在Iso+miR-499 mimic組中比異氟烷中顯著下降（P < 0.05）。

2.5 抑制miR-499降低異氟烷處理的A/R心肌細(xì)胞中LDH、CK、AST的含量

測量心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo)LDH、CK、AST在細(xì)胞上清液中的含量。LDH的測量結(jié)果表明，與Control組[（563±53）U/L]比較，A/R組[1033±89）U/L]中的LDH含量顯著上升，并在3%異氟烷處理后[Iso組，（662±49）U/L]下降（P < 0.05）；并且與Iso組比較，Iso+miR-499 mimic組中的LDH[（914±32）U/L]明顯提升（P < 0.05）。CK的測量結(jié)果顯示，A/R組中的CK含量[（2316±184）U/L]比Control組[（1335±130）U/L]中顯著提升，Iso組中的CK含量[（15616±140）U/L]比A/R組中明顯降低，異氟烷+miR-499 mimic組的CK含量[（1967±106）U/L]比Iso組中提升（P < 0.05）。AST的測量結(jié)果表明，與Control組[（25±5）U/L]比較，ALT在A/R組[（48±6）U/L]中顯著上升，并在3%異氟烷處理后[Iso組，（29±4）U/L]下降；同時與Iso組比較，Iso+miR-499 mimic組中的ALT[（36±5）U/L]明顯提升（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，從細(xì)胞水平上研究心肌的功能已成為心血管研究的重要方向之一[13]。已有研究表明，臨床用麻醉劑，如七氟醚、噴妥鈉、異丙酚能抑制術(shù)后心機(jī)功能的損傷[14-15]。異氟烷作為常用的全身麻醉劑之一，能夠抵抗A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，但其具體調(diào)控機(jī)制還未見報道[16]。Liu等[12]研究表明，miR-499可能參與到麻醉劑七氟烷對心血管疾病術(shù)后的保護(hù)作用。為此，本研究以A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞為損傷模型，觀察異氟烷和miR-499對損傷的心肌細(xì)胞損傷作用，以期為以后心血管疾病麻醉劑的使用提供新的理論依據(jù)。

在心肌細(xì)胞缺氧的時候，能量代謝過程受到阻礙，心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜受到損傷[17]。復(fù)氧后，隨著大量氧氣的涌入，產(chǎn)生大量的氧自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，使生物膜受到損傷，造成細(xì)胞內(nèi)鈣的超載，并使細(xì)胞膜的通透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損[18]。為了探討異氟烷保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制，本研究用H9c2細(xì)胞進(jìn)行A/R處理。梁冰等[16]的研究中選用2%濃度作為異氟烷的處理濃度，本研究中分別用1%、2%、3%濃度的異氟烷預(yù)處理心肌細(xì)胞隨后進(jìn)行A/R處理，觀察不同濃度的異氟烷對心肌細(xì)胞生長的影響以進(jìn)行濃度篩選，結(jié)果顯示異氟烷可以顯著抑制A/R引起的心肌細(xì)胞活力下降，并且其作用具有濃度依賴性，提示異氟烷可以減輕A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，與Yan等[13]的研究結(jié)果一致。心肌細(xì)胞的生長隨著異氟烷濃度的增加而提升，但是在濃度增加的過程中，增長幅度變低，在3%異氟烷處理組中，心肌細(xì)胞的生長已較高，推測在更高濃度的異氟烷處理組中細(xì)胞生長會繼續(xù)增加，但增幅較小。因此本研究選用3%作為后續(xù)實驗中異氟烷的處理濃度。同時本研究檢測出在受損的心肌細(xì)胞中miR-499的表達(dá)顯著上升，并且在加入異氟烷預(yù)處理后下降，與miR-499在麻醉劑七氟烷中的結(jié)果一致[12]。MiR-499過表達(dá)抑制了異氟烷對受損的心肌細(xì)胞活力的提升，以上結(jié)果提示，miR-499可能參與異氟烷對受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是嚴(yán)格受到調(diào)控的細(xì)胞自主死亡形式[19]。細(xì)胞的凋亡過程是心肌細(xì)胞受到損傷病變后的重要表現(xiàn)之一[20]。在A/R的過程中，缺氧是心肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)者，而隨后的復(fù)氧會加速細(xì)胞的凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示異氟烷可以減輕A/R的心肌細(xì)胞凋亡，與其他研究者的報道一致。Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的蛋白酶，在多種凋亡途徑的下游充當(dāng)效應(yīng)蛋白，是重要的凋亡執(zhí)行者[22]。促凋亡分子Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2分屬于Bcl蛋白家族。研究表明，Bcl-2過表達(dá)對多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用，同時Bax通過調(diào)節(jié)Bcl-2的活性而起到促凋亡作用[23]。本研究檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，異氟烷能夠抑制Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達(dá)，并提升抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步說明異氟烷可以抵制A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。同時，miR-499過表達(dá)可以減緩異氟烷對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，說明異氟烷可以通過調(diào)節(jié)miR-499減輕A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步說明異氟烷對受損心肌細(xì)胞的作用，本研究檢測了細(xì)胞上清液中LDH、CK和ALT的含量。LDH、CK和AST為心肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)酶，其漏出量的多少可以反映細(xì)胞膜的受損嚴(yán)重程度[24-25]。本研究結(jié)果顯示，異氟烷減輕了A/R誘導(dǎo)的細(xì)胞中LDH、CK和AST的含量，提示異氟烷對受損的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時此作用可被miR-499過表達(dá)所拮抗。

綜上所述，本研究結(jié)果提示異氟烷可以抑制A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞生長降低、細(xì)胞凋亡及受損，而miR-499的過表達(dá)可以拮抗其保護(hù)作用，為心腦血管疾病患者的臨床麻醉提供理論研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-01-03 本文編輯：張瑜杰）