茅育蕾 陳柏慶

[摘要] 目的 探究皮膚病理組織免疫組化技術(shù)的常見問題與操作的質(zhì)量控制對免疫組化制片質(zhì)量的影響。 方法 按照隨機數(shù)字表法將20只雄性6～8周齡的BALB/c小鼠分為觀察組和對照組，每組各10只，觀察組使用質(zhì)量控制后的制片法，采用完整免疫組化步驟；對照組使用傳統(tǒng)的制片，采用簡易免疫組化步驟，比較兩組制片質(zhì)量和免疫組化結(jié)果。 結(jié)果 觀察組制片的質(zhì)量明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；觀察組免疫組化圖片質(zhì)量明顯優(yōu)于對照組。 結(jié)論 免疫組化任一環(huán)節(jié)都可影響免疫組化結(jié)果，質(zhì)量控制可以提升免疫組化技術(shù)綜合效果，有利于進一步提高病情的臨床診斷，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 皮膚組織；免疫組化；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R392.33 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0163-04

Common problems and quality control of immunohistochemical technique in pathological tissue

MAO Yulei CHEN Boqing

Department of Pathology， Affiliated Hospital of Shaoxing University Pathology Shaoxing， Zhejiang Province， Shaoxing 312000， China

[Abstract] Objective To investigate the common problems of immunohistochemistry in skin pathology and the influence of quality control on the quality of immunohistochemical preparation. Methods Twenty male BALB/c rats aged from 6 to 8 weeks old were divided into observation group and the control group by random number table， with 10 rats in each group. The observation group was used by the making slices method after quality control and adopted the complete immunohistochemical procedures and the control group with the traditional production method and the simple immunohistochemical procedures. The making slices quality and immunohistochemistry of two groups were compared. Results The making slices quality in observation group was better than control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The quality of the immunohistochemical pictures in observation group was significantly better than the control group. Conclusion Immunohistochemistry can affect the results of immunohistochemistry in any aspect. Quality control can enhance the comprehensive effect of immunohistochemistry， which is helpful to further improve the clinical diagnosis of the disease and it is worth promoting.

[Key words] Skin tissue； Immunohistochemistry； Quality control

免疫組化技術(shù)作為臨床病理學(xué)重要的診斷手段，將病理診斷提升到較高水平，具有廣泛而深入的應(yīng)用，成為病理工作者不可缺少的重要內(nèi)容[1-3]。免疫組化技術(shù)過程包括組織固定、玻片選擇、組織切片、抗原修復(fù)、抗體選擇及應(yīng)用和顯色等，每一步都會影響到制片的質(zhì)量和臨床病理診斷的準(zhǔn)確性，因此質(zhì)量控制必不可少[4-6]。本研究以小鼠皮膚組織為例，比較不同制片、固定、脫水方法對免疫組化染色效果的影響，討論皮膚病理組織免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，為嚴(yán)格控制制片質(zhì)量，獲取滿意結(jié)果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用動物室提供的20只6～8周齡BALB/c小鼠，雄性，體重18～22 g，由紹興市動物研究所提供，合格證：SCXK（蘇）2010-0001，于SPF三級動物室飼養(yǎng)，自由飲水，通風(fēng)良好，晝夜正常變化，室溫21～24℃，濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。按照隨機數(shù)字表法將小鼠分為觀察組和對照組，每組各10只，取小鼠背部皮膚組織作為研究使用的標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器

甲醛（化試有限公司），二甲苯（化試有限公司），酒精（化試有限公司），組織脫水機（德國，LEICA，TP1020），石蠟包埋機（德國，LEICA，EG1140H），石蠟切片機（德國，LEICA，RM2130），烤片機（德國，LEICA，HI1220），光學(xué)顯微鏡（日本，OLYNPUS）。

1.3 實驗方法

實驗前2 d采用戊巴比妥鈉（80 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉，刮除其背部毛發(fā)，形成約2 cm×2 cm大小的暴露區(qū)域，單籠飼養(yǎng)2 d后，取小鼠背部正中全層皮膚，約1 cm×1 cm大小。觀察組使用質(zhì)量控制后的病理切片，對照組使用傳統(tǒng)的病理切片。將兩組免疫組化病理切片進行顯微鏡下觀察比較，并將觀察組和對照組的病理資料進行統(tǒng)計分析，找出日常工作中容易出現(xiàn)的常見問題，并詳細(xì)制訂解決的方法，比較觀察組和對照組的制片質(zhì)量及診斷價值。其中每組5只進行PCNA染色，5只進行CD3染色，具體如下：

對照組：按照科室傳承經(jīng)驗方式進行操作。①取材后福爾馬林固定12～24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋；②常規(guī)切片；③石蠟切片烘烤30 min后常規(guī)二甲苯脫蠟至水，蒸餾水清洗1次；④PBS清洗1 min，玻片組織上滴加PCNA、CD3的單克?、窨梗?℃孵育過夜；⑤次日PBS洗滌3次，每次1 mim后，滴加相應(yīng)Ⅱ抗，37℃孵育1 h；⑥配制新鮮DAB顯色液，玻片由PBS洗滌3次，每次3 mim，經(jīng)DAB分別染色1、3 min后終止顯色；⑦顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果并拍照記錄。石蠟切片烤片時間短，清洗步驟時間、次數(shù)減少，且未進行過氧化物酶封閉和抗原熱修復(fù)。

觀察組：采用質(zhì)量控制的操作。①取材時注意組織的完整性，保持組織原貌，勿擠壓；及時用Bouin′s液固定并注意固定液與標(biāo)本的比例，達到固定充分；根據(jù)皮膚組織特點有針對性地進行修取、脫水、透明、浸蠟、包埋，透明時間嚴(yán)格控制在2 h以內(nèi)，浸蠟溫度控制在60～65℃，包埋需要恒溫，避免氣泡、裂隙出現(xiàn)。②切片時肉眼觀察切片是否平整，避免空洞、卷曲，標(biāo)記清晰，鏡下觀察切片是否污染，選取質(zhì)量優(yōu)質(zhì)的制片。③石蠟切片65℃烘烤2 h后常規(guī)二甲苯脫蠟至水，蒸餾水清洗2次。④95℃枸櫞酸鈉溶液中水浴加熱10 min進行抗原修復(fù)。⑤自然降至室溫后，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，每次3 mim。⑥玻片組織上滴加PCNA、CD3的單克隆Ⅰ抗，4℃孵育過夜。⑦次日PBS洗滌3次，每次3 mim后，滴加相應(yīng)Ⅱ抗，37℃孵育1 h。⑧配制新鮮DAB顯色液，玻片由PBS洗滌3次，每次3 mim，經(jīng)DAB分別染色1、3 min后終止顯色。⑨顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果并拍照記錄。

抗原活性強度用DAB顯色表示：完全不著色（-），淺棕色（+），棕色（++），深棕色（+++）。有效制片率=（優(yōu)質(zhì)片數(shù)量+良質(zhì)片數(shù)量）/總制片數(shù)量×100%。病理切片分級標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組制片質(zhì)量比較

觀察組有效制片率為97.50%，對照組有效制片率為80.00%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 兩組皮膚組織CD3、PCNA免疫組化結(jié)果比較

觀察組組織結(jié)構(gòu)完整清晰，可清楚分析表皮層、真皮層等，免疫組化著色均勻，陽性點明顯無雜質(zhì)；對照組組織破損嚴(yán)重，著色不均勻，陽性點不明顯，雜質(zhì)較多；對照組背景顏色明顯深于觀察組。見圖1（封四）。

3 討論

免疫組化技術(shù)結(jié)合了免疫學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)等學(xué)科，根據(jù)抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)與化學(xué)顯色原理，使組織切片中待測細(xì)胞的化學(xué)成分通過過氧化物酶等標(biāo)記出來，便于顯微鏡的觀察與統(tǒng)計，對輔助病理診斷和鑒別診斷有決定性作用[7-8]。然而免疫組化技術(shù)在實際操作過程中，受到多種因素的影響，環(huán)環(huán)相扣，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可導(dǎo)致結(jié)果的難以讀取或不準(zhǔn)確，出現(xiàn)診斷差錯[9-11]。為做到免疫組化技術(shù)的準(zhǔn)確，操作過程要嚴(yán)格執(zhí)行臨床病理操作規(guī)范，做到免疫組化流程的標(biāo)準(zhǔn)化。

本研究以小鼠皮膚組織為例，從取材、制片和免疫組化步驟方面對免疫組化技術(shù)常見問題與質(zhì)量控制進行了探討。首先活檢取材需注意組織完整性，可反映病變特征，避免厚薄不均、變性和壞死[12]。組織的固定、脫水、透明、浸蠟和包埋是制片的重要環(huán)節(jié)。組織固定的目的在于保持細(xì)胞原有的形態(tài)和成分，防止細(xì)胞自溶，常用固定劑為福爾馬林和多聚甲醛[13-14]。固定時間隨組織的不同而變化，固定不及時、不完全會導(dǎo)致細(xì)胞長期缺氧而引發(fā)細(xì)胞腫脹，改變靶抗原，或?qū)е录?xì)胞溶解、抗原丟失，不利于免疫組化結(jié)果的可靠性；而固定時間過長也可導(dǎo)致組織脆性增加，影響制片質(zhì)量，在福爾馬林中固定一般不可超過24 h[15]。為了保持組織細(xì)胞的原始結(jié)構(gòu)和組織細(xì)胞中待測抗原的活性，組織標(biāo)本必須盡快置于固定液中充分固定，所有的試劑需及時更新，避免影響染色效果。同時，應(yīng)考慮固定劑質(zhì)量，包括pH值、濃度、滲透壓和緩沖液等[16-17]。

組織固定后，進行脫水、透明、包埋、切片。切片時切片過厚染液不易透過，切片過薄則易碎，且應(yīng)避免刀痕、氣泡、組織折疊等[18]。石蠟切片的干燥必不可少，然而烤片溫度過高會導(dǎo)致出現(xiàn)邊緣假象，且容易降低抗原的反應(yīng)性，在石蠟切片制備過程中，由于需要反復(fù)經(jīng)二甲苯、酒精等有機溶劑的浸泡處理以及浸蠟，容易發(fā)生飛片現(xiàn)象，應(yīng)對切片進行充分干燥，防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生，因此烤片溫度一般不高于58℃，時間約為6～12 h，此時對石蠟切片的免疫組化染色結(jié)果不會有影響，操作應(yīng)認(rèn)真注意[19-20]。

制片過程中，為保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進行的固定液固定，破壞了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物活性，為此需進行抗原修復(fù)。而抗原修復(fù)的步驟，又容易引起組織的飛片、破碎等。因此同時保證這兩個條件，需要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，以免影響臨床病理診斷[21]。實驗過程中，抗原修復(fù)是免疫組化的關(guān)鍵步驟，常采用為微波修復(fù)和水浴鍋修復(fù)，用以打開固定液造成的蛋白結(jié)合，使抗原暴露，便于提高免疫組化染色的敏感性，以保證獲得準(zhǔn)確的實驗效果[21]。為了去除組織細(xì)胞中的雜質(zhì)干擾，避免非特異性染色，常使用過氧化物酶封閉液方法把其中的雜蛋白去掉，同時避免了背景色的影響。

結(jié)合制片過程中的關(guān)鍵步驟，本研究采用了傳統(tǒng)制片操作（對照組）和質(zhì)量控制后操作（觀察組），在取材、制片和免疫組化操作上都有所差異。本研究結(jié)果提示，觀察與與對照組制片質(zhì)量比較，觀察組有效制片率為97.50%，對照組有效制片率為80.00%。對照組的石蠟切片出現(xiàn)較多脫片、褶皺不平和飛片的情況，結(jié)合操作步驟，說明在切片、展片的步驟后，石蠟切片的干燥對保持組織的完整性非常重要，同時觀察組進行了易造成切片完整性破壞的微波修復(fù)，但組織切片的完整性仍優(yōu)于對照組，再次表明石蠟切片干燥可利于組織與玻片的充分黏合。

顯微鏡下觀察皮膚組織免疫組化結(jié)果顯示，觀察組組織結(jié)構(gòu)完整清晰，可清楚分析表皮層、真皮層等，免疫組化著色均勻，陽性點明顯無雜質(zhì)；對照組組織破損嚴(yán)重，著色不均勻，陽性點不明顯，雜質(zhì)較多。這與對照組實驗中清洗時間短、次數(shù)少有關(guān)，因組織粘貼不牢固，過多的清洗易引起組織脫落，為此減少清洗的強度，導(dǎo)致了清洗不徹底，而出現(xiàn)較多的雜質(zhì)。觀察組與對照組陽性點均為深棕色，觀察組陽性點均為顆粒狀，大小均一，分布規(guī)律，數(shù)量較多，但對照組分布散亂，數(shù)量少，且成片存在。同時，觀察組的非特異性染色明顯增多，背景顏色較深，說明抗原修復(fù)和過氧化物酶封閉對暴露抗原、減少背景顏色較為重要，通過此步驟可獲得較滿意的染色效果。

臨床應(yīng)用免疫組化技術(shù)，需將各個環(huán)節(jié)做到標(biāo)準(zhǔn)化，采用標(biāo)準(zhǔn)化程序進行操作，對免疫組化技術(shù)進行質(zhì)量控制，達到病理診斷、預(yù)后判斷和臨床治療的快速、準(zhǔn)確的目的。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化操作，可以提高免疫組化技術(shù)水平，做出精確的病理免疫組化結(jié)果，提高臨床病理診斷的準(zhǔn)確率。為了更好的應(yīng)用免疫組化技術(shù)，需要進一步加強對免疫組化的研究，在實際應(yīng)用中不斷的提高免疫組化診斷的效果。

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（收稿日期：2017-11-15 本文編輯：萬 平）