付麗娟 張怡 張亞男 高巍 陳巖

150036哈爾濱,黑龍江省醫(yī)院感染內(nèi)科(付麗娟高巍 陳巖),檢驗(yàn)科(張亞男)；150040哈爾濱,黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院外三科(張怡)

固有免疫是是機(jī)體抵御病原體入侵和擴(kuò)散的第一道防線,也是機(jī)體免疫防御的基礎(chǔ)。病原體感染機(jī)體后,固有免疫首先調(diào)動(dòng)起來(lái)抑制病原體的復(fù)制,并清除病原體。固有免疫的特點(diǎn)是反應(yīng)快且具有普遍性。機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)主要包括：物理和化學(xué)的各種屏障,各種細(xì)胞如吞噬細(xì)胞、釋放炎癥因子的細(xì)胞、NK細(xì)胞等以及各種細(xì)胞因子等[1]。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染作為世界性的公共衛(wèi)生難題嚴(yán)重危害人類健康。HBV侵入機(jī)體后,于肝細(xì)胞的細(xì)胞核及胞漿中復(fù)制、裝配、釋放導(dǎo)致更多細(xì)胞感染[2]。同時(shí)機(jī)體調(diào)動(dòng)固有免疫及特異性免疫應(yīng)答將病毒清除。目前機(jī)體的固有免疫在抗HBV中的作用受到眾多學(xué)者關(guān)注,但針對(duì)核苷(酸)類似物抗HBV治療導(dǎo)致耐藥的慢乙肝患者機(jī)體的固有免疫狀態(tài)研究較少。核苷(酸)類似物抗HBV耐藥是HBV DNA出現(xiàn)耐藥位點(diǎn)變異,導(dǎo)致核苷(酸)類似物抗病毒療效下降[3]。核苷(酸)類似物耐藥是否會(huì)導(dǎo)致宿主的固有免疫狀態(tài)發(fā)生變化,這種變化是耐藥引起的,還是固有免疫狀態(tài)的變化促進(jìn)了核苷(酸)類似物的耐藥,研究較少。新發(fā)現(xiàn)的與抗病毒有關(guān)的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22 的表達(dá)有助于機(jī)體清除乙肝病毒[4-5],但在長(zhǎng)期應(yīng)用核苷(酸)類似物抗病毒治療導(dǎo)致耐藥的患者中固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22的表達(dá)情況尚不明確,是否固有免疫因子 IFN-α、IFN-γ、Mov10,TRIM22 的表達(dá)水平與核苷(酸)類似物耐藥機(jī)制有關(guān)。因此本研究通過(guò)檢測(cè)核苷(酸)類似物耐藥患者的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10 和 TRIM22 的 mRNA 表達(dá)水平,探討導(dǎo)致核苷(酸)類似物耐藥的宿主固有免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者應(yīng)用核苷(酸)類似物抗病毒治療出現(xiàn)臨床耐藥患者28例,交叉耐藥患者10例,多重耐藥患者18例,患者來(lái)自黑龍江省醫(yī)院感染內(nèi)科2011年12月份至2015年1月份門診及病房就診患者。20例健康對(duì)照者來(lái)自黑龍江省醫(yī)院體檢中心。所有入選患者及健康體檢者均知情同意。(1)入選病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。(2)既往服用核苷(酸)類似物藥物持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月。(3)核苷(酸)類似物聯(lián)合或序貫治療應(yīng)用藥物種類≥2種。(4)核苷(酸)類似物抗病毒治療出現(xiàn)原發(fā)性治療失敗、部分病毒學(xué)應(yīng)答、病毒學(xué)突破、生化學(xué)突破。(5)分組標(biāo)準(zhǔn)：交叉耐藥(cross resistance)：是指針對(duì)一種抗病毒藥物出現(xiàn)耐藥變異對(duì)另一種或幾種抗病毒藥物也出現(xiàn)耐藥。多重耐藥(multidrug resistance)：是指耐藥位點(diǎn)不同的藥物進(jìn)行單藥序貫或聯(lián)合治療時(shí),HBV可在不同藥物的靶位上出現(xiàn)耐藥變異,從而產(chǎn)生變異病毒株,且對(duì)多種藥物耐藥。對(duì)兩種核苷(酸)類似物耐藥的為交叉耐藥組；對(duì)兩種以上核苷(酸)類似物耐藥的為多重耐藥組。(6)排除標(biāo)準(zhǔn)：停藥復(fù)發(fā)患者；同時(shí)合并有HCV、HDV、HEV、HIV感染；合并自身免疫性肝病及其他自身免疫性疾病；合并遺傳代謝性肝臟疾病；妊娠或哺乳期婦女；合并嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病或精神疾病者。健康對(duì)照組(1)既往否認(rèn)肝臟疾病史(否認(rèn)乙肝、丙肝、丁肝、酒精肝、自身免疫性肝病史)。(2)生化學(xué)正常。(3)乙肝五項(xiàng)檢查結(jié)果：HBsAg(-)、HBsAb(+)或(-)；HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。(4)梅毒及 HIV抗體陰性。(5)自身抗體系列：陰性。(6)無(wú)長(zhǎng)期飲酒史。(7)近6個(gè)月未服用過(guò)任何藥物。(8)無(wú)其他系統(tǒng)性疾病(如腦梗塞、高血壓、糖尿病、腫瘤,自身免疫性疾病等)。

1.2 固有免疫因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)健康對(duì)照組及入選病例組每人均采集靜脈血4ml,EDTA抗凝,人淋巴細(xì)胞分離液,按說(shuō)明書操作分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。Trizol法提取PBMC總RNA。提取得到的RNA質(zhì)量用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。SYBR Real-Time PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司)；按照試劑盒說(shuō)明書完成操作。RT-PCR引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法變量不服從正態(tài)分布,組間差異比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)方法；變量不服從正態(tài)分布,相關(guān)分析采用spearman秩相關(guān)分析。

表1 相關(guān)基因逆轉(zhuǎn)錄mRNA引物參考序列Tab.1 Reference sequences of the primers for relevant genes reverse transcription mRNA

2 結(jié)果

2.1 耐藥組及正常對(duì)照組固有免疫因子 IFN-α,Mov10,IFN-γ和TRIM22的mRNA表達(dá)耐藥組與正常對(duì)照組固有免疫因子 IFN-α、Mov10、IFN-γ和TRIM22的mRNA表達(dá)比較,耐藥組固有免疫因子Mov10、TRIM22的mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖1,A、B)。 兩組間 IFN-α、IFN-γ的 mRNA 表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1,C、D)。

2.2 耐藥組固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)相關(guān)性分析機(jī)體固有免疫因子IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22均具有抗乙肝病毒作用,其作用機(jī)制不同,其互相之間也具有相關(guān)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,TRIM22 mRNA表達(dá)水平與IFN-α mRNA,IFN-γ mRNA,Mov10 mRNA 表達(dá)水平均相關(guān)(圖 2,A、B、C)；Mov10 mRNA 表達(dá)水平與TRIM22 mRNA、IFN-αmRNA表達(dá)水平具有相關(guān)性,與IFN-γmRNA表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性(圖2,C、D、E)；IFN-αmRNA表達(dá)水平與 TRIM22 mRNA,Mov10 mRNA,IFN-γmRNA表達(dá)水平均相關(guān)(圖2,A、D、F)。

2.3 多重耐藥組與交叉耐藥組各免疫因子mRNA表達(dá)水平比較多重耐藥組與交叉耐藥組固有免疫因子 TRIM22、Mov10、IFN-α 和 IFN-γ 的 mRNA表達(dá)水平相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖3)。

3 討論

目前眾多學(xué)者研究已證實(shí)固有免疫因子Mov10、TRIM22、IFN-α、IFN-γ 具有抗病毒作用。 人的Mov10基因位于1號(hào)染色體短臂1P13.2,主要在胚胎干細(xì)胞、睪丸、胸腺等器官表達(dá)。研究證實(shí)[7-8]HIV感染的Mov10小鼠模型體內(nèi)無(wú)病毒血癥發(fā)生,說(shuō)明Mov10模型小鼠具有抗HIV的作用。Mov10可以在多個(gè)階段抑制HIV復(fù)制：Mov10以RNA依賴的方式與HIV-1核酸蛋白相互作用,從而抑制HIV的包裝；Mov10屬于SF-1RNA解螺旋酶,它在RNA干擾途徑起重要作用,是RNA干擾抗病毒途徑的重要參與者；Mov10基因編碼的mRNA處理體(P小體)的標(biāo)志蛋白可有效的嵌合入病毒體內(nèi),減少病毒感染。人類TRIM基因家族編碼的蛋白有70多種,TRIM22又名為Staf 50。TRIM蛋白作為機(jī)體固有免疫因子參與宿主的防御機(jī)制主要是伴隨干擾素和病毒刺激干擾病毒的轉(zhuǎn)錄[9]。TRIM蛋白抗病毒的機(jī)制[10-11]主要是調(diào)節(jié)正常蛋白代謝和清除降解病毒蛋白,TRIM22具有泛素E3連接酶活性在體外IFN-α可誘導(dǎo)TRIM22的上調(diào),進(jìn)一步增強(qiáng)其抗病毒功能；靈長(zhǎng)類的TRIM22蛋白可被干擾素誘導(dǎo)上調(diào),在抗病毒固有免疫中起到重要的作用；在人TRIM5aC端的SPRY結(jié)構(gòu)域能特異識(shí)別HIV-1的核衣殼CA,抑制衣殼蛋白CA的脫殼從而抗HIV復(fù)制。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)在機(jī)體的固有免疫中起重要作用。病毒、細(xì)菌感染會(huì)誘導(dǎo)生成Ⅰ型干擾素,T細(xì)胞的免疫應(yīng)答會(huì)誘導(dǎo)生成Ⅱ型干擾素,干擾素具有抗感染(細(xì)菌、病毒),提升機(jī)體免疫應(yīng)答作用[12]。

圖1 耐藥組與正常對(duì)照組固有免疫因子mRNA表達(dá)水平比較A.Mov10 mRNA； B.TRIM22 mRNA； C.INF-α mRNA； D.INF-γ mRNAFig.1 The mRNA level of inherent immune factors in drug-resistant group compared with the normal control group

圖2 耐藥組固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)相關(guān)性A：TRIM22 與 IFN-α；B：TRIM22 與 IFN-γ；C：Mov10 與 TRIM22；D：Mov10 與 IFN-α；E：Mov10 與 IFN-γ；F：IFN-α 與 IFN-γFig.2 The correlation of mRNA levels of the inherent immune factors including IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22A：TRIM22 and IFN-α；B：TRIM22 and IFN-γ；C：Mov10 and TRIM22；D：Mov10 and IFN-α；E：Mov10 and IFN-γ；F：IFN-α and IFN-γ

圖3 多重耐藥組與交叉耐藥組固有免疫因子TRIM22(A)、Mov10 m(B)、IFN-α(C)和IFN-γ(D)的mRNA表達(dá)水平比較Fig.3 The mRNA levels of inherent immune factors including TRIM22(A),Mov10(B),IFN-α(C)and IFN-γ(D)in the multidrug resistant group and cross resistance group

本研究發(fā)現(xiàn)在耐藥組CHB患者PBMC中Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明應(yīng)用核苷酸類似物抗病毒治療的過(guò)程中,隨著HBV DNA耐藥株的增多,Mov10、TRIM22表達(dá)亦增強(qiáng),有利于機(jī)體抑制HBV DNA復(fù)制以及清除病毒。但也有報(bào)道TRIM22 mRNA表達(dá)在未治療的CHB患者中是明顯降低的,表明其免疫功能下降,其推斷TRIM22是HBV感染的伴隨指標(biāo)[13]。本研究中核苷酸類似物耐藥組中TRIM22 mRNA表達(dá)明顯升高,推測(cè)在抗耐藥HBV中TRIM22發(fā)揮重要作用。TRIM22作為固有免疫因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng),亦反映機(jī)體的免疫狀態(tài),其在未治療的CHBHBV DNA患者中是明顯降低的,推測(cè)此類患者機(jī)體免疫狀態(tài)尚未激活,或處于乙肝免疫耐受狀態(tài),固有免疫因子TRIM22表達(dá)降低,而本研究中耐藥CHB患者處以免疫激活期,在核苷類藥物治療過(guò)程中出現(xiàn)HBV DNA耐藥,TRIM22高表達(dá)與機(jī)體免疫系統(tǒng)清除病毒相關(guān),具體的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。耐藥CHB組 IFN-αmRNA、IFN-γmRNA表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),表明機(jī)體固有免疫抗耐藥HBV機(jī)制不是通過(guò)干擾素途徑達(dá)到抗病毒作用的。耐藥的HBV不能刺激機(jī)體使IFN-α mRNA、IFN-γ mRNA 表達(dá)上調(diào),清除乙肝病毒耐藥株,耐藥株持續(xù)存在,導(dǎo)致臨床抗病毒療效差,病情進(jìn)展。本課題還探討了在耐藥組中這4個(gè)固有免疫因子的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)耐藥組中 TRIM22 mRNA表達(dá)水平與 IFN-αmRNA,Mov10 mRNA和IFN-γmRNA均呈正相關(guān),表明 TRIM22抗耐藥HBV機(jī)制與多種固有免疫因子相關(guān),推論它在抗耐藥HBV中起重要作用。另外,Mov10 mRNA表達(dá)水平與IFN-αmRNA和TRIM22 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān),與IFN-γmRNA無(wú)關(guān),推測(cè)Mov10抗耐藥HBV機(jī)制不是通過(guò)干擾素激發(fā)的免疫途徑清除病毒的。IFN-α mRNA 表達(dá)水平與 IFN-γ mRNA、Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA表達(dá)正相關(guān),可推論 IFN-α mRNA表達(dá)與其他固有免疫因子在抗耐藥HBV過(guò)程中起到協(xié)同抗病毒作用。固有免疫因子間的相關(guān)性較為復(fù)雜,機(jī)制仍不明確,尚需進(jìn)一步研究。

總之,本研究結(jié)果表明核苷(酸)類似物抗HBV治療出現(xiàn)臨床交叉耐藥及多耐藥的發(fā)生與機(jī)體的固有免疫因子有相關(guān)性,但具體的發(fā)生機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

利益沖突無(wú)