溫小菁 陶澤新 溫紅玲

250012濟南,山東大學公共衛(wèi)生學院微生物檢驗學系感染性疾病防控重點實驗室(溫小菁、溫紅玲)；250014濟南,山東省疾病預防控制中心山東省傳染病預防控制重點實驗室(陶澤新)

腸道病毒71(EV71)和柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16,CV-A16)都是引發(fā)手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原體。與CV-A16不同的是EV71感染常導致重癥HFMD的發(fā)生[1]。大多數HFMD的患兒癥狀輕微,主要的臨床表現為發(fā)熱,手部、足部、臀部等部位出疹和口腔黏膜皰疹。EV71還可侵染患兒的中樞神經系統(tǒng),誘發(fā)多種神經系統(tǒng)并發(fā)癥,如無菌性腦膜炎、脊髓炎,以及神經源性心肌炎等,甚至引起患兒死亡[2]。最近幾年,EV71引發(fā)的HFMD在亞洲地區(qū)多個國家廣泛流行[3]。在中國,2008—2016年累計報告HFMD患兒共16 291 933例,死亡3 515例[4],嚴重威脅著我國兒童的健康,死亡病例大多由EV71感染導致,但其致病機制尚未明確。迄今為止,尚缺乏針對EV71感染的有效的抗病毒藥物。3D蛋白是一種RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),是病毒復制不可缺少的酶,在病毒復制過程中發(fā)揮著重要作用。通過對3D蛋白結構與功能的研究可進一步的了解EV71致病機制,并為抗病毒藥物研發(fā)提供靶標。

1 EV71病毒的基本結構和形態(tài)

EV71病毒屬小核糖核酸病毒科,病毒顆粒無包膜,其衣殼是20～30 nm的正二十面體立體對稱結構。EV71的病毒核酸屬單股正鏈RNA,基因組含7 000多個核苷酸,兩側分別是高度保守的5′UTR和帶有多聚核苷酸尾的3′UTR,只含一個開放閱讀框架(open reading framework,ORF),編碼含有約2 100個氨基酸的多聚蛋白,該多聚蛋白可進一步水解為P1、P2、P3 3個前體蛋白。P3亦可水解為4種非結構蛋白：3A、3B、3C和3D[5]。有研究顯示在病毒復制過程中,非結構蛋白發(fā)揮著至關重要的作用[6]。

2 EV71 3D蛋白的基本結構

EV71 3D蛋白含有約462個氨基酸,相對分子質量為53×103。EV71 3D蛋白的晶體結構于2010年首次被解析出,像閉合的人的右手手掌,包含“手指”、“拇指”、“手掌”等結構域[7],與脊髓灰質炎病毒(PV)的3D蛋白晶體結構相比,EV71 3D蛋白的晶體結構具有更寬敞的拇指結構域。N-端結構域將手指結構域與拇指結構域連接在一起,手指結構域能與模板發(fā)生結合,拇指結構域則與引物發(fā)生相互作用。另外,3D蛋白具有6個由氨基酸組成的保守區(qū)域,分別為 Motif A、B、C、D、E、F,在其他正鏈RNA病毒中也是如此,其中3D蛋白活性位點GDD位于Motif C上。EV71 3D蛋白存在兩處不同于其他蛋白的地方：Motif E位于“手掌”區(qū)域,Motif F位于“手指”區(qū)域[8],這可能與其在病毒復制過程中的作用有關?！笆种浮眳^(qū)域還可以進一步細分為：“食指”、“小指”、“中指”、“無名指”等區(qū)域。 X 射線衍射分析揭示了EV71 3D蛋白對核苷酸或核苷酸類似物具有很高的親和力,據此可得到EV71 3D蛋白與核苷酸或核苷酸類似物形成的復合物的高分辨率的電子密度圖。

3 EV71 3D的功能

EV71 3D蛋白是由病毒基因組編碼的,主要負責病毒RNA的復制[5,9]。3D蛋白可參與VPg的尿苷?；磻?位于3D蛋白手掌區(qū)域底部的311位點是VPg結合位點,結合后能夠穩(wěn)定VPg分子,VPg在病毒復制起始中扮演重要角色[10],因此3D蛋白可通過VPg起始蛋白復制。在3D蛋白的作用下,病毒以自身RNA為模板復制出負鏈RNA,再以自身復制出的RNA為模板,復制得到子代正鏈RNA。即3D蛋白主要負責EV71病毒基因組的合成與延伸[11-12]。下面將從3D蛋白對病毒復制、激活炎性反應、減弱干擾素的抗病毒活性等方面進行闡述。

3.1 3D蛋白對病毒復制的作用有研究顯示SUMO(small ubiquitin-like modifier)化修飾和泛素化修飾均可作用于3D蛋白,后者依賴于前者,SUMO化修飾是一種翻譯后修飾,這種修飾具有調節(jié)蛋白質的功能,兩種修飾都具有增強3D蛋白穩(wěn)定性的作用,因而可通過對蛋白質的調節(jié)來促進病毒復制[13]。殘基K159和L150/D151/L152負責3D蛋白的SUMO化,若SUMO化位點突變則會影響3D蛋白的活性及病毒的復制。若提高EV71感染細胞中SUMO-1的水平,能增加3D蛋白的SUMO化和泛素化水平,繼而導致EV71的復制增強。而在3C蛋白中情況則相反,3C的SUMO化會使3C發(fā)生降解并且最終將導致病毒復制的減少。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是柯薩奇病毒B3和EV71有效復制所必需的[14]。

EV71可利用宿主細胞的修飾進行自身的有效復制。此外EV71的3D蛋白還可以通過阻滯細胞周期為EV71的產生提供有利條件?？滤_奇病毒A16中也可出現以上情形[15-17]。Yu等[18]研究顯示,3D通過增強cyclin E1的表達和CDK2 T160的磷酸化誘導S期控制蛋白的表達譜,使細胞周期停滯于S期,從而可以促進EV71的復制。相反,G0/G1和G2/M阻滯卻可抑制EV71復制。研究結果還顯示在EV71感染后,細胞周期蛋白E1表達上調,而細胞周期蛋白A2和細胞周期蛋白B1表達下調,在24～30 h間S期阻滯最為明顯,且僅在被完整病毒感染的細胞中才能檢測到顯著的S期阻滯。以上內容可以得出調節(jié)與細胞周期相關的多種細胞因子的轉錄水平和翻譯后水平可支持病毒復制。據報道[19],一些病毒可通過操縱細胞周期蛋白和CDK進程來調節(jié)細胞周期的進程。3D蛋白促進病毒復制的途徑還可通過作用于PI3K/AKT/m TOR信號通路引發(fā)宿主細胞凋亡,繼而促進復制[20]。有研究顯示[21],在對3D蛋白的第251位氨基酸進行突變后,在35℃培養(yǎng)時突變體的病毒復制基本未發(fā)生改變,而在39.5℃培養(yǎng)時突變體病毒的復制比35℃培養(yǎng)時減少了100倍,病毒的復制能力也相應的下降。第251位氨基酸位于3D蛋白結構的手指域和手掌域motifA之間的α-螺旋中。作為對照在對3D蛋白的第328位氨基酸進行突變后,病毒的復制能力未發(fā)生改變。這表明3D蛋白第251位氨基酸可能是EV71的毒力位點,且該位點可能具有溫度敏感性。Barton等[22]研究顯示脊髓灰質炎病毒3DM394T突變體的起始復制復合物中的負鏈RNA的合成在34℃時顯示正常,而在39.5℃時負鏈RNA的合成迅速受到抑制,且該抑制不可逆。Arita等[23]研究顯示將脊髓灰質炎病毒株的溫度敏感位點引入到EV71的3D編碼區(qū)中,EV71毒株也表現出了很強的溫度敏感性,復制能力發(fā)生了相應的改變。由此可看出3D蛋白中可能含有影響病毒毒力的位點。

3.2 3D蛋白可以激活炎性反應先天性免疫系統(tǒng)是一個高度保守的信號網絡體系,對于保護宿主感染和清除入侵病原體非常重要[24]。先天性免疫應答的一個重要組成部分是炎性體的激活,一種蛋白的胞質復合物激活Casp-1將產生促炎性細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)[25]。 病毒感染宿主后,宿主可通過啟動自身的免疫系統(tǒng)來清除入侵的病原體,從而達到保護自身的作用。NLRP3炎性體的活化是先天性免疫應答的重要組成部分之一,在調節(jié)宿主免疫和病毒感染中起重要作用,在其暴露于病原體時可被誘導,隨后活化的NLRP3炎性體可以調節(jié)IL-1β的成熟,IL-1β隨后通過激活免疫細胞并誘導許多次級促炎細胞因子而在炎癥反應中起關鍵作用。NLRP3可識別包括腸道病毒71在內的許多RNA病毒來調節(jié)先天免疫和病毒復制[26]。Wang等[27]研究表明,EV71通過激活NLRP3炎性體誘導巨噬細胞和外周血單核細胞中IL-1β的產生和分泌,EV71 3D聚合酶通過與NLRP3結合形成特定的環(huán)狀結構3D-NLRP3-ASC來促進NLRP3炎性復合體的組裝,從而導致IL-1β的活化。在環(huán)狀復合體中,3D位于最里層,中間兩層分別是3D-NLRP3復合體和NLRP3-ASC復合體,ASC位于結構體的外部。NLRP3包含 3個重要的域,分別是：PYD,NACHT和LRR。其中NACHT和LRR域可與3D蛋白發(fā)生相互作用。此外,3D還改變了NLRP3、ASC和pro-Casp-1的亞細胞分布,并與炎性體成分共定位與NLRP3結合形成大斑點。研究發(fā)現的3D蛋白激活炎性反應這一功能與病毒的復制密切相關,將會為病毒感染的預防和治療提供思路。

3.3 3D蛋白能減弱干擾素的抗病毒活性干擾素可通過多種方式發(fā)揮其抗病毒活性,可通過抑制病毒組分的轉錄和翻譯而干擾病毒的復制。I型干擾素對體外和體內EV71感染具有抗病毒活性[28]。EV71感染可能改變IFN-α反應,導致逃避抗病毒策略和免疫發(fā)病機制。Wang等[29]研究顯示,EV71 3D可減弱IFN-r誘導的STAT1酪氨酸磷酸化繼而減弱干擾素的抗病毒活性。在3D表達的細胞中STAT1的表達減少不僅體現在蛋白水平還體現在mRNA水平,在此過程中IFN-r受體的表達不會受到干擾。同樣的EV71 2A蛋白也可通過減弱IFN-r誘導的STAT1的絲氨酸磷酸化減弱干擾素的抗病毒活性,促進病毒復制。EV71可通過幾種免疫逃避策略來減弱I型干擾素應答。在3D表達細胞中STAT1的額外表達顯著逆轉了IFN-r誘導的IRF1轉錄激活的降低。3D蛋白可能有助于先天免疫的逃避。3D蛋白如何調控STAT1的活化和表達仍舊是未知的,還需要更多的實驗來證實。

4 有關抑制劑對3D蛋白功能的影響

3D蛋白是一種RNA聚合酶,宿主細胞中不存在這種RNA聚合酶,因此研究3D蛋白的結構和功能可為抗病毒藥物的研發(fā)提供思路。迄今還未開發(fā)出針對3D蛋白的抗病毒藥物,可從3D蛋白的晶體結構入手,根據3D蛋白的晶體結構特征研制相關的抑制劑,用于防治EV71引發(fā)的HFMD。

金黃三羧酸(aurintricarboxylic acid,ATA)是一種對細胞功能具有多效性的獨特化合物,是EV71復制的有效抑制劑。Hung等[30]研究顯示,ATA能夠抑制病毒編碼的3D蛋白的活性,繼而有效地抑制EV71的復制。且該抑制作用發(fā)生在病毒復制周期的早期階段。3C和2 A蛋白酶的活性卻不受ATA的影響。據報道ATA可抑制吸附,從而通過干擾病毒包膜糖蛋白(gp120)和細胞表面上的CD4受體之間的相互作用來阻斷HIV的復制[31]。Chen等[32]報道ATA也是HCV的NS5B復制酶抑制劑。此外,ATA對EV71的抑制可能不僅僅是由于對3D蛋白抑制所致,還需要進一步的研究來探究ATA是否可作用于影響EV71復制的其他蛋白或細胞。

DTriP-22(4{4-[(2-bromo-phenyl)-(3-methylthiophen-2-yl)-methyl]-piperazin-1-yl}-1-pheny-1H-pyr-azolo[3,4-d]pyrimidine)是1種EV71抑制劑,通過減少病毒 RNA的積累,抑制病毒的復制,DTriP-22對EV71的復制主要體現在對3D聚合酶活性的抑制,可能是通過阻斷核苷酸進入3D聚合酶的空腔而干擾3D聚合酶的活性。不僅可以抑制3D聚合酶延伸活性,還可在病毒復制期間干擾3D聚合酶的其他功能,繼而影響病毒的復制。DTriP-22對其他類型的腸道病毒也具有很強的抗病毒活性,對HSV-1和HSV-2兩種病毒卻無抑制性[33]。

黃芩苷Baicalin是從黃芩根中提取的1種黃酮類化合物,用黃芩苷(50μg/ml)處理EV71感染的細胞,結果顯示3D的mRNA水平明顯地受到抑制,而VP1、2A和3C的mRNA水平完全不受影響,由此可見黃芩苷可在EV71復制的早期階段通過干擾3D聚合酶轉錄和翻譯對EV71感染表現出有效的抗病毒作用[34]。以上3種化合物均可在不同程度上抑制3D蛋白的活性,這種抑制性可為針對3D蛋白靶點的抗病毒藥物的研制提供思路。

5 展望

據報道,我國每年由EV71感染所致的重癥和輕癥HFMD所耗費用高達十幾億元[35]。目前沒有能夠有效治療HFMD的特異性藥物,主要還是感染后的對癥治療。我國現有3家疫苗企業(yè)生產的EV71疫苗已獲國家相關部門批準上市,目前為止國外還沒有上市此類疫苗。近幾年有關腸道病毒與自噬的研究較多,有研究表明EV71病毒中的一些非結構蛋白可通過促進自噬體的積累促進自身復制[36],3D蛋白與病毒自噬的關系尚不十分明確,如上文中所提及的3D蛋白可通過作用于PI3K/AKT/m TOR信號通路促進病毒復制,而此通路與細胞自噬密切相關,3D蛋白是否通過作用于自噬促進病毒復制尚需進一步實驗驗證。3D蛋白在EV71感染過程中發(fā)揮重要作用,可促進病毒復制、激活炎性反應、減弱干擾素的抗病毒活性等等。盡管目前已經發(fā)現了3D蛋白的一些功能,但缺乏對此蛋白的全面的認識。還需針對3D蛋白的結構和功能開展進一步的研究,這將有助于尋找EV71病毒的毒力位點并闡明EV71的致病機制,也為新型疫苗及相關的抗病毒藥物的研制提供新的思路。

利益沖突無