楊玉穎 王靜 唐偉 朱貞 李云逸 王嘉瑜 李崇山 劉暢

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系(楊玉穎、劉暢)；200336上海市疾病預(yù)防控制中心病原生物檢定所(楊玉穎、王靜、唐偉、李云逸、王嘉瑜、李崇山)；102206北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(朱貞)

風(fēng)疹(rubella)是一種常見的發(fā)熱出疹性疾病,其病因為風(fēng)疹病毒(rubella virus,RV)感染。RV是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員,雖然RV只有一個血清型,卻有多個基因型。世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)推薦使用E1蛋白編碼區(qū)739個核苷酸(nucleotide,nt)(nt8731～9469),作為進行RV分子流行病學(xué)研究的區(qū)域[1]。根據(jù)該739nt片段核苷酸最小差異為8% ～10%的原則,RV在遺傳進化樹上分為2個分支(Clade 1和Clade 2)。目前在2個分支內(nèi)共劃分為13個基因型,其中 12 個為正式基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C),另外一個為臨時基因型(1a)[2]。

此前有報道2B基因型RV于2011年在上海流行[3]。為研究2B基因型RV是否依然在本市存在流行及其基因特征,完善上海市風(fēng)疹分子流行病學(xué)監(jiān)測基線數(shù)據(jù),選擇2011—2017年上海市報告疑似麻疹/風(fēng)疹病例中經(jīng)實驗室診斷排除麻疹,確定為風(fēng)疹病例所對應(yīng)咽拭子標(biāo)本進行RV分離和鑒定,并對病毒E1基因擴增測序進行基因特征分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與運送所有病例信息均來自中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)(China Information System for Disease Control and Prevention,CISDCP)和麻疹監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)(Measles Surveillance System,MSS)。本研究中所用的所有病例標(biāo)本均采集自符合《上海市麻疹風(fēng)疹監(jiān)測方案》中所規(guī)定病例定義的疑似麻疹或風(fēng)疹病例,由上海市轄區(qū)范圍內(nèi)各醫(yī)院或各區(qū)疾病控制中心采集、運送。2014年起由各麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實驗室進行核酸檢測,檢測結(jié)果陽性者再送上海市疾病預(yù)防控制中心進行麻疹病毒分離。同時采集血清標(biāo)本由各麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實驗室進行IgM抗體檢測。上海市疾病預(yù)防控制中心定期對結(jié)果進行復(fù)核。

1.2 病毒分離、核酸提取及RV鑒定按照《中國麻疹/風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(2015版)》操作,實驗所用Vero/SLAM細胞由中國疾病控制中心國家麻疹/風(fēng)疹實驗室提供。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德國)從第3代病毒培養(yǎng)物中提取病毒RNA,具體操作參照試劑盒說明書。選擇引物RV11-RV12鑒定RV[4-5],使用PrimeScript One Step RT-PCR kit(Takara,中國)擴增片段185 bp。擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳,陽性標(biāo)本進行后續(xù)實驗。

1.3 E1基因的擴增與測定從GenBank中下載RV基因組全序列,并據(jù)此設(shè)計E1基因引物：正義鏈為 F1：5′-TCGTCCTGCTGGTCCCGTGG-3′,F2：5′-CCCCACCGACACCGTGATGA-3′,F3： 5′-GTGGGTC ACGCCTGTCATAG-3′；反義鏈為 R1：5′-GTTGTCCGT GCGGCGTGTTG-3′,R2：5′-GCGGTGACGAACTTCC CAGG-3′,以及文獻引物 RUB3：5′-TTTT TTTTTTT TTTTTTTCTATACAGCAACAGGTGC-3′[6]。 使用 Sup erscriptⅢ Platinum Taq High Fidelity kit(Invitrogen,美國)擴增病毒E1基因的全序列(nt8136～9780)：55℃逆轉(zhuǎn)錄30 min,94℃變性2 min,94℃ 10 s、55℃15 s、68℃ 1min,40個循環(huán)后,68℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳鑒定,陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析使用Sequencher 5.4.6軟件(GeneCode,美國)拼接序列,使用Mega 6.0軟件[7]進行序列比對,采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹,進化樹進行了1 000次重復(fù)構(gòu)建；使用BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9.0軟件[8]分析核苷酸和氨基酸(amino acid,aa)序列同源性及變異情況。

2 結(jié)果

2.1 2011—2017年上海市風(fēng)疹監(jiān)測流行病學(xué)信息2011—2017年上海市風(fēng)疹報告發(fā)病率為0.01～3.57/10萬,2012年發(fā)病率最高,2016—2017年發(fā)病率持續(xù)下降。全市各區(qū)均有病例報告,報告病例數(shù)以浦東新區(qū)、嘉定區(qū)、松江區(qū)和閔行區(qū)最多。年齡分布以15～39歲青少年和成年人最多。全年均有病例發(fā)生,4～6月份發(fā)病數(shù)最多,其中2015年以1～5月份病例數(shù)最多。

2.2 RV的分離鑒定與基因型的確定2011—2017年符合條件咽拭子標(biāo)本共計684份,病毒分離物經(jīng)RV11-RV12引物對擴增鑒定,共分離到395株RV,全部為散發(fā)病例,且標(biāo)本均采集自出疹前后5 d內(nèi)。395株RV分離株均為14歲以上青少年或成年人,無兒童病例,具體信息見表1。經(jīng)上述3對引物擴增后,共獲得377株RV分離株739nt片段核苷酸序列,基于該片段與WHO各基因型參考株序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),377株RV分離株中109株為1E基因型,且這些分離株與來自中國的參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)親緣性關(guān)系更近(bootstrap值為98)；268株為2B基因 型,其中 RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和 RVi/Shanghai.CHN/21.16/等5株分離株在2B基因型中成一個獨立小分支。具體基因型鑒定情況見表2。

表1 上海市2011—2017年RV分離株信息匯總Tab.1 Information about RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

2.3 核苷酸序列差異及變異位點分析所有1E基因型分離株之間核苷酸序列相差0～22個核苷酸(0% ～3.0%)；與該基因型2株WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之間的核苷酸序列相差8～29個核苷酸(1.1%～4.0%)。與該基因型中國參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)相比,所有1E基因型分離株E1基因 739nt片段中共有 4個位點(nt8737、nt8836、nt9160和nt9316)存在完全一致的突變,以上位點突變后的堿基與馬來西亞參考株(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)一致。除RVi/Shanghai.CHN/30.12/2外,其他108株1E基因型分離株在nt9244位點發(fā)生T→C的無義突變(圖2)。所有2B基因型RV分離株之間核苷酸序列相差0～48個核苷酸(0% ～6.5%)；與該基因型3株WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv. ISR/0.68/)之間相差12～48個核苷酸(1.7% ～6.5%),且與美國華盛頓州的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差異最小。與上述WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)相比,所有2B基因型分離株E1基因739nt片段中在 nt9092(Adenine→Guanine,A→G),以及5株成獨立小分支的2B基因型分離株在nt9371(G→A)和nt9387(Thymine→Cytosine,T→C)位點均發(fā)生突變,導(dǎo)致所編碼氨基酸的變化(圖2)；此外,與3株WHO參考株相比,所有2B基因型分離株在nt8737位點,以及除5株成獨立小分支外的其他2B基因型分離株在 nt8740、nt8749、nt8770、nt8 977 和 nt9 112 等位點均發(fā)生無義突變。

表2 上海市2011—2017年RV分離株基因型鑒定Tab.3 Genotype identification of RV isolates during 2011-2017 in Shanghai

圖1 2011—2017年上海市部分RV分離株與WHO各基因型參考株基于E1基因739nt(nt8731～nt9469)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains for each genotype based on the 739 nucleotides(nt8731～nt9469)of E1 gene

2.4 氨基酸序列差異及變異位點分析所有1E基因型分離株之間相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%),與該基因型2株 WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/和RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)之間的氨基酸序列相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%)；所有2B基因型RV分離株之間氨基酸序列相差0～5個氨基酸殘基(0% ～2.1%),與該基因型3株WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2、 RVi/Washington. USA/16.00/和 RVi/TelAviv.ISR/0.68/)之間的氨基酸序列相差0～4個氨基酸殘基(0% ～1.7%),且與美國華盛頓州的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00/)差異最小。

圖2 2011——2017年上海市部分RV分離株與WHO參考株基于E1基因739nt(nt8731～9469)變異位點分析Fig.2 The nucleotide mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the 739 nucleotides(nt8731～9469)of E1 gene

本研究所有377株RV分離株中發(fā)現(xiàn)的核苷酸突變大多為無義突變,并不引起所編碼氨基酸的變化,只有少數(shù)幾個位點存在氨基酸突變(圖3)。所有RV分離株在E1蛋白aa279位點均為纈氨酸(Valine,Val279),與1E和2B基因型WHO參考株相比,僅和2B基因型WHO參考株(RVi/Anhui.CHN/0.00/2)不同,該參考株此位點為異亮氨酸(Isoleucine,Ile279),此位點為E1蛋白的抗原表位。除了RVi/Shanghai.CHN/26.11/2之外的所有中國1E基因型RV在aa338位點發(fā)生相同突變,由亮氨酸(Leucine,Leu338)突變?yōu)楸奖彼?Phenylalanine,Phe338),而2B基因型分離株以及其他基因型WHO參考株均未發(fā)生改變。同時發(fā)現(xiàn)5株成獨立分支的2B基因型分離株在aa372位點發(fā)生Val372→Ile372突變,在aa377位點發(fā)生 Val377→丙氨酸(Alanine,Ala377)的突變。

圖3 2011—2017年上海市部分RV分離株與WHO參考株基于E1蛋白(aa159～404)氨基酸變異位點分析Fig.3 The amino acid mutation analysis of part of rubella strains isolated during 2011-2017 in Shanghai compared to the WHO reference strains based on the E1 protein(aa159～404)

3 討論

根據(jù)WHO所推薦的RV基因分型標(biāo)準(zhǔn),確定以El蛋白編碼區(qū)的739個核苷酸(nt8731～9469,aal59～404)作為靶序列進行基因型劃分和分子流行病學(xué)研究[1]。

本研究對上海市2011—2017年報告疑似麻疹風(fēng)疹病例中分離到的RV進行分子流行病學(xué)分析。除2017年外,其余年份均分離到RV。377株RV分離株全部屬于1E基因型或2B基因型,所有1E基因型分離株與來自中國的WHO參考株(RVi/Shandong.CHN/0.02/)親緣性關(guān)系更近。李崇山等[3]報道1E基因型是2001—2011年本市RV優(yōu)勢流行基因型,本研究中1E基因型仍是2011—2013年上海市RV優(yōu)勢流行基因型,但在2014年則被2B基因型取代,自2015年起未再監(jiān)測到1E基因型。上述研究發(fā)現(xiàn)上海市1E基因型分離株分為兩個進化分支(Cluster A和Cluster B)[3],其中Cluster A中分離株數(shù)量較多,且包括2001—2011年多個年份的分離株,但在本次研究中所有1E基因型分離株均屬于Cluster A。朱貞等[10]對2001—2015年中國大陸流行的1E基因型RV分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)類似的進化結(jié)果。上海地區(qū)2B基因型RV在2011年首次被發(fā)現(xiàn)[3],本次研究再次監(jiān)測到2B基因型RV在上海的流行,且2012—2016年期間持續(xù)存在,并替代1E基因型成為2014—2016年上海市RV優(yōu)勢流行基因型。

從系統(tǒng)發(fā)生樹上發(fā)現(xiàn),5株分離株(RVi/Shanghai.CHN/16.14/6、 RVi/Shanghai.CHN/15.16/4、 RVi/Shanghai.CHN/19.16/2、RVi/Shanghai.CHN/20.16/和RVi/Shanghai.CHN/21.16/)在2B基因型中成一個獨立小分支,并且在aa372和aa377位點發(fā)生突變,這兩個位點的突變?yōu)檫@5株分離株獨有,其他分離株和WHO參考株中未發(fā)現(xiàn)該突變。研究發(fā)現(xiàn)在2015年貴州省的一起風(fēng)疹暴發(fā)中有2株2B基因型RV在aa377位點發(fā)生相同突變[9]。經(jīng)核苷酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn),所有268株2B基因型分離株與從美國華盛頓州2000年分離到的WHO參考株(RVi/Washington.USA/16.00)最為接近。除上述5株分離株外的263株2B基因型分離株與上海市之前分離自2011年的3株2B基因型(SH11009、SH11052和SH11106)之間的核苷酸序列同源性達98%以上。經(jīng)與其他國家或地區(qū)的RV比對發(fā)現(xiàn),分離自2011年的4株及2013年的1株RV與中國香港的1株RV(GenBank No.：FJ656218)核苷酸同源性為100%,提示存在跨區(qū)域傳播的可能。

本次研究同時發(fā)現(xiàn)除1株(RVi/Shanghai.CHN/26.11/2)外的所有中國1E基因型RV E1蛋白aa338位點發(fā)生相同突變(Leu338→Phe338),朱貞等人[10]在對我國2003—2007年RV基因特征分析中首次發(fā)現(xiàn)中國1E基因型RV在這一位點的獨有突變,之后在浙江省[11]、吉林省[12]等地RV分離株基因特征分析中都相繼發(fā)現(xiàn)了相同的突變。但李崇山等人[4]的研究中,上海地區(qū)2001年分離到的7株1E基因型RV中有5株未發(fā)生這一突變,aa338位點仍為 Leu338,與 WHO 1E基因型(RVi/Kuala Lumpur.MYS/0.01/)及2B基因型參考株相同,說明這一突變可能于2001年前后還未在所有1E基因型RV中發(fā)生。由于我市2010年之前的RV樣品量少,故未能擴大檢測范圍確定這一突變的具體時間。通過1E基因型RV比對發(fā)現(xiàn),俄羅斯(2006年)、中國(2007年臺灣,2012年香港)、美國(2008年)以及日本(2010—2011年)的RV分離株中都存在這一位點的突變,其中部分毒株已被證實由中國大陸輸入[13-14]。

截止2015年,除WHO非洲區(qū)和東地中海區(qū)之外的其他4個區(qū)域都確立了消除或控制風(fēng)疹和CRS的目標(biāo),WHO美洲區(qū)在2015年宣布阻斷本土RV的傳播,率先實現(xiàn)了消除風(fēng)疹和CRS的目標(biāo)。目前,上海市風(fēng)疹病毒學(xué)監(jiān)測還不夠全面,有待進一步加強監(jiān)測的力度,為追溯RV的傳染源和傳播鏈以及制定切實有效的風(fēng)疹疫苗免疫策略提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突無