周靜娣 高國生 劉興暉 胡耀仁

315010寧波市第二醫(yī)院(周靜娣、高國生、胡耀仁)；200135上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院(劉興暉)

全世界有超過1.7億人感染丙型肝炎病毒(hepatctis C virus,HCV),嚴(yán)重危害人類健康[1]。絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 1型(SPINK1)是一種炎性蛋白,以較高的濃度存在于胰腺和胰液中,在健康人群中,肝臟是SPINK1的主要來源。研究表明,SPINK1在肝癌患者表達(dá)水平升高[2],HCV是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的主要誘因之一,但目前為止,HCV對SPINK1的調(diào)節(jié)作用還不是很清楚。本研究旨在探討HCV對SPINK1的調(diào)節(jié)作用及其臨床意義,為HCV相關(guān)疾病的診治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 一般資料收集HCV感染的患者92例,包括男性53例,女性39例,平均年齡51.8±20.3歲。選取86例健康體檢者作為對照組,其中男性49例,女性37例,平均年齡42.2±15.7歲,所有患者均排除其他嗜肝病毒感染,且均未接受干擾素(IFN)和直接抗病毒(DAA)藥物抗病毒治療。

1.2 試劑含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞由本室保存[3]；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司；SPINK1單克隆抗體購自購自美國美國Sigma公司；SPINK1 ELISA檢測試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Huh7.5.1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%的胎牛血清(含100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素)DMEM培養(yǎng)基中,在37℃,5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每個實驗組做3個復(fù)孔。

1.3.2 RT-PCR檢測：提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞及其對照細(xì)胞的總RNA,MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,SPINK1基因的檢測引物：上游引物：5’-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3’；下游引物：5’-AGTATTTCCATCAGTCCC-3’,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時設(shè)立β-actin作為對照[2],產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 Western blot(WB)：細(xì)胞裂解液裂解Huh7.5.1細(xì)胞,加入上樣緩沖液后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上,分別加入SPINK1單克隆抗體(1∶2 000)和羊抗兔多克隆抗體(1∶5 000),設(shè)立β-actin作為對照,采用底物化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯色。

1.3.4 ELISA檢測：細(xì)胞上清及血清SPINK1的含量采用ELISA進(jìn)行檢測,操作按照說明書進(jìn)行,實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件,SPINK1含量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組間均數(shù)的比較采用t檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 RT-PCR檢測SPINK1 mRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of SPINK1 mRNA determined by RT-PCR

圖2 Western blot檢測SPINK1蛋白的表達(dá)Fig.2 Expresssion of SPINK1 protein detected by Western blot

圖3 感染HCV的Huh7.5.1細(xì)胞與對照細(xì)胞上清中SPINK1的含量比較(?P＜0.05)Fig.3 Comparison of SPINK1 content of Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cell supernatant(?P＜0.05)

2.1 HCV上調(diào)SPINK1 mRNA和蛋白的表達(dá)我們采用RT-PCR和WB檢測了JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對照細(xì)胞SPINK1 mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,感染了HCV的Huh7.5.1細(xì)胞SPINK1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高。見圖1和圖2。細(xì)胞上清中SPINK1檢測結(jié)果顯示,感染了HCV的Huh7.5.1細(xì)胞SPINK1含量(58.7±16.2μg/L)明顯高于對照細(xì)胞(41.2 ±10.5μg/L),統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P=0.016)。見圖3。

2.2 HCV感染患者SPINK1血清水平升高為證實HCV對SPINK1的調(diào)節(jié)作用,我們采用ELISA檢測了HCV患者和正常對照組SPINK1的血清含量。結(jié)果表明,與對照組相比(17.9±4.5μg/L),SPINK1含量在丙肝患者組明顯升高(67.5±19.8 μg/L),(P=0.016)。見圖4。同時,Spearman相關(guān)分析顯示年齡與SPINK1血清學(xué)水平之間無相關(guān)性(r=0.116,P＞0.05)。

3 討論

圖4 正常對照組和HCV患者組SPINK1的血清水平比較(?P＜0.05)Fig.4 Comparison of serum levels of SPINK1 of the normal control group and HCV patients group

SPINK1又被稱為腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑(TATI)和胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(PSTI),是一種分泌性多肽,位于5號染體(5q32),基因組約為7.5 kb,基因產(chǎn)物由79個氨基酸組成,其主要生理功能是抑制胰蛋白酶原等多種絲氨酸蛋白酶原活性,拮抗胰腺等組織的“自身消化”[4-5]。研究表明,SPINK1在乙肝病毒(HBV)和HCV患者肝組織表達(dá)升高[6],但HCV能否在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)SPINK1的表達(dá)還不清楚。

本研究檢測了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞株及其對照細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,HCV能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)SPINK1的表達(dá)。SPINK1是分泌性蛋白,細(xì)胞上清檢測結(jié)果也顯示含JFH-1株 HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞株高于對照細(xì)胞,表明HCV能夠在細(xì)胞水平促進(jìn)SPINK1的合成和分泌,進(jìn)一步的血清檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCV患者SPINK1的血清含量明顯高于正常對照組(因正常對照組和患者之間的年齡存在差異,為避免表達(dá)水平的差異是由于年齡原因?qū)е碌?故進(jìn)一步對年齡與SPINK1血清水平之間的相關(guān)性作了分析,結(jié)果證明兩者之間無相關(guān)性),證實了HCV能夠在體內(nèi)外上調(diào)SPINK1的表達(dá)。

需要指出的是,IFN和直接抗病毒(DAA)藥物是臨床治療HCV的常用藥物,但目前未見抗病毒藥物對SPINK1表達(dá)影響的相關(guān)報道,因此,本研究我們選取了未接受干擾素(IFN)和直接抗病毒(DAA)藥物抗病毒治療HCV患者。

HCV感染是肝癌的主要誘因之一,病毒與宿主的相互作用在肝癌的發(fā)生機制中起重要作用[7],病毒感染機體后誘發(fā)機體誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致肝細(xì)胞大量重生而誘發(fā)致癌效應(yīng)[8]。Lu X等證實SPINK1能夠抑制細(xì)胞的凋亡[9],同時,HCV的復(fù)制能夠促進(jìn)SPINK1的表達(dá)[6],本研究也證實了HCV在體內(nèi)外上調(diào)SPINK1的表達(dá),因此,HCV感染宿主肝細(xì)胞后,通過促進(jìn)SPINK1的表達(dá)來抑制肝細(xì)胞凋亡,以利于HCV在肝細(xì)胞內(nèi)不斷的復(fù)制和機體持續(xù)的炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生[5]。

研究證實,SPINK1的表達(dá)水平與肝癌進(jìn)程相關(guān),高水平SPINK1對于肝癌的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的預(yù)測作用[2],因此,血清中SPINK1的檢測將為HCV相關(guān)疾病的診治提供線索。

總之,本研究探討了HCV對SPINK1的調(diào)節(jié)作用,為揭示HCV的致癌機理奠定了一定基礎(chǔ),但HCV調(diào)節(jié)SPINK1表達(dá)的具體分子機制及IFN對SPINK1表達(dá)的影響有待進(jìn)一步研究。

利益沖突無