雅雪蓉 董澤豐 夏瑜 沈強(qiáng)

215004蘇州市疾病預(yù)防控制中心

2013年3月在華東地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)人感染H7N9病毒病例[1],病毒全基因序列分析表明H7N9病毒是新型多源重組禽流感病毒[2]。2013年以來(lái)該病毒每年冬春季都會(huì)在中國(guó)大陸造成不同程度的流行,目前中國(guó)已經(jīng)經(jīng)歷了五個(gè)流行季[3]。世界衛(wèi)生組織官網(wǎng)(http：//www.who.int/csr/don/23-may-2017-ah7n9-china/en/)數(shù)據(jù)顯示,截至2017年5月13日,已經(jīng)報(bào)告了1 486例實(shí)驗(yàn)室確診病例,總體病死率約為39.4%(586/1 486),并且出現(xiàn)了一些聚集性病例,不能排除病毒具有有限的人傳人的可能。第五波的H7N9流行季實(shí)驗(yàn)室確診的病例數(shù)超過(guò)了以往任何1次[4-5],引起了廣泛的社會(huì)關(guān)注。

蘇州位于長(zhǎng)三角中部,是H7N9病毒的主要流行地區(qū)之一。自從2013年4月份蘇州市確診首例本地人感染H7N9病例后,每個(gè)流行季蘇州都會(huì)受到不同程度的影響。為了解蘇州地區(qū)H7N9病毒的流行特征,本研究采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)2016年10月份至2017年5月份間蘇州地區(qū)疑似病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了H7N9病毒核酸檢測(cè),H7N9病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本送中國(guó)疾控預(yù)防控制中心進(jìn)行病毒分離和基因序列測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源2016年10月份至2017年5月份期間,采集不明原因肺炎病例咽拭子樣本,同時(shí)收集患者人口學(xué)基本數(shù)據(jù)、可疑暴露史、發(fā)病日期以及主要臨床癥狀等信息。

1.2 病毒檢測(cè)參照QIAsymphony Viral/Bacteria Mini Kit試劑盒說(shuō)明書提取樣本核酸。按照A/B流感病毒通用Real-time PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)流感病毒RNA。A型陽(yáng)性樣本再檢測(cè)pdmH1N1,H3,H5N1,H7N9以及H9N2亞型流感病毒。反應(yīng)條件均為：50℃ 30 min,95℃ 5 min,95℃ 15 s,55℃ 40 s。所有樣本24 h內(nèi)完成檢測(cè),H7N9核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本-80℃凍存。

1.3 HA基因測(cè)序H7N9病毒分離和HA基因測(cè)序在國(guó)家流感中心P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,將200μl病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本接種到9～11日齡SPF級(jí)雞胚尿囊腔,35℃培養(yǎng)72 h。收獲尿囊液樣本并提取病毒核酸用于基因測(cè)序。

1.4 HA基因序列分析同源矩陣分析采用DNASTAR軟件,多序列比對(duì)使用ClustalX2軟件,MEGA6.0軟件建立HA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,方法為Neighbor-Joining,bootstrap=1000。HA全基因參考序列來(lái)自GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)。NetNGlyc 1.0 server用于預(yù)測(cè)HA蛋白的糖基化位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 病例特征2016年10月份至2017年5月份,蘇州疾病控制中心共確診了55例人感染H7N9禽流感病毒患者,死亡22例,總體病死率為40%(22/55)。83.6%(46/55)的病例在發(fā)病前10 d內(nèi)直接接觸過(guò)活禽或暴露于活禽市場(chǎng).如圖1所示,H7N9病毒主要在冬春季流行,蘇州市H7N9病毒第五波流行季較以往開始的早,確診的病例數(shù)也有明顯增加。在第五波 H7N9確診病例中,男性占比為72.7%(40/55),中位年齡為58歲(24～89歲)。職業(yè)分布中以退休老人和農(nóng)民居多。所有病例發(fā)病時(shí)均伴有高燒(39.4℃,37.8～42℃)和咳嗽等臨床癥狀。

圖1 2013—2017年蘇州市H7N9確診病例時(shí)間分布Fig.1 Time distribution of patients infected with H7N9 virus in Suzhou city from 2013 to 2017

2.2 HA基因核酸序列分析蘇州分離到的H7N9病毒血凝素HA基因全長(zhǎng)1 683 bp,如圖2所示,H7N9禽流感病毒有兩大分支,分別為長(zhǎng)三角分支(Yangtze River Delta)和珠三角分支(Pearl River Delta)。HA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹表明蘇州分離株均屬長(zhǎng)三角分支,與A/Zhengjiang/1/2017(H7N9)等華東地區(qū)其他地方第五波流行季分離到的病毒同源性最高。與前幾波流行季分離的病毒有共同的祖先,但是分屬不同的進(jìn)化分支,與本市在2013年第一波H7N9流行季分離的病毒株A/Suzhou/3/2013(H7N9)也不在同一分支上,這表明H7N9病毒仍在不停的進(jìn)化。此次蘇州分離株HA基因同源性為98.7%～100%。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)的HA基因的核酸序列一致性為97.6%～98.1%。所有蘇州分離株HA基因核酸序列1 014位和1 015位之間沒(méi)有核苷酸插入,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似A/Guangdong/SP440/2017和A/Taiwan/1/2017等的高致病性突變株。

圖2 蘇州市2016—2017年第5波H7N9疫情病毒分離株HA基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene of H7N9 viruses isolated from the fifth wave in Suzhou city from 2016 to 2017

2.3 氨基酸序列分析2016—2017年流行季分離到的蘇州株HA蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)關(guān)鍵氨基酸沒(méi)有改變。與A/Shanghai/02/2013(H7N9)序列相比,所有蘇州分離株T168 A,G195 V,Q235 L和G237S(H7 Numbering)等RBS中關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸沒(méi)有發(fā)生突變。H7N9病毒的受體結(jié)合偏好性也沒(méi)有發(fā)生改變,仍具備與 SA-α2,3-Gal和 SA-α2,6-Gal結(jié)合的能力。廣東地區(qū)分離到的高致病性突變株A/Guangdong/SF003/2016(H7N9)血凝素切割位點(diǎn)的氨基酸序列為PEVPKRKRTAR↓GLF,但是所有蘇州分離株HA1和HA2之間切割位點(diǎn)的氨基酸序列仍為PEIPKGR↓GLF(333～342),337位和338位之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RKRT四個(gè)氨基酸的插入,血凝素連接肽氨基酸序列并未發(fā)生改變,說(shuō)明在蘇州地區(qū)流行的H7N9病毒對(duì)禽類仍然是低致病性的。

2.4 HA蛋白的糖基化位點(diǎn)分析根據(jù)NetNGlyc軟件的分析結(jié)果,HA蛋白總共有5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),其中HA1有3個(gè),HA2有2個(gè)。5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)分別是30(N-G-T)、46(N-A-T)、249(N-D-T)、421(N-W-T)和493(N-N-T)。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)相比,蘇州分離株HA蛋白潛在糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和位置沒(méi)有發(fā)生改變。

3 討論

蘇州人感染H7N9禽流感病毒的病死率為40%,與全國(guó)數(shù)據(jù)(39.4%)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),遠(yuǎn)高于季節(jié)性流感。由于第五波H7N9疫情發(fā)生時(shí)間早,分布地域廣,確診感染人數(shù)多等原因,引起廣發(fā)的社會(huì)關(guān)注[3]。此次疫情尚未完全結(jié)束,蘇州目前也正遭受H7N9病毒的影響。在蘇州市人感染H7N9病毒的主要途徑是接觸活禽或暴露于活禽市場(chǎng),H7N9病毒的檢出高峰在春節(jié)前1個(gè)月,這可能與此時(shí)處在活禽消費(fèi)高峰,人們暴露于活禽或活禽市場(chǎng)的機(jī)會(huì)增加有關(guān),此外,冬季氣溫較低,H7N9病毒在外環(huán)境中存活時(shí)間較長(zhǎng)也可能是感染人數(shù)增加的原因。在此波疫情中,H7N9病毒的流行特征沒(méi)有發(fā)生明顯改變一致,與之前的研究結(jié)果[6-8]。

與季節(jié)性流感病毒偏好結(jié)合SA-a-2,6-Gal受體不同,禽流感病毒偏好結(jié)合SA-α-2,3-Gal受體[9-10]。禽流感病毒必須突破種間屏障,能夠與SA-a-2,6-Gal有效結(jié)合才能感染人類。而病毒能否與SA-a-2,6-Gal結(jié)合主要影響因素是由受體結(jié)合位點(diǎn)中關(guān)鍵氨基酸。研究表明禽流感病毒RBS中T168 A,G195 V,Q235 L和G237S(H7 Numbering)突變能夠增加病毒與人類受體的結(jié)合能力[11-14]。與候選疫苗株A/Shanghai/02/2013(H7N9)相比,蘇州分離株在這些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生突變,這表明H7N9病毒目前還不具備在人際間持續(xù)傳播的能力。

HA基因序列分析結(jié)果表明所有蘇州分離株均為長(zhǎng)三角分支,并且H7N9病毒仍在不停的進(jìn)化。第五波流行季中臺(tái)灣和廣東地區(qū)出現(xiàn)了高致病性突變株,發(fā)現(xiàn)HA蛋白的切割位點(diǎn)插入了RKRT四個(gè)氨基酸,使原本對(duì)禽類低致病的H7N9病毒突變?yōu)閷?duì)禽類高致病性[5],這對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)將產(chǎn)生重要影響。但是,目前所有蘇州分離株的HA蛋白切割位點(diǎn)氨基酸序列并未發(fā)生改變,蘇州地區(qū)流行的H7N9病毒對(duì)禽類仍然是低致病性的。

流感病毒糖基化位點(diǎn)的減少有利于病毒免疫逃避以及與受體的結(jié)合[15-16]。研究表明H7N9病毒HA蛋白頭部糖基化位點(diǎn)的改變會(huì)對(duì)病毒的適應(yīng)性產(chǎn)生影響[17]。蘇州H7N9病毒分離株HA蛋白潛在的糖基化位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生可使病毒傳播能力增強(qiáng)的改變。

值得警惕的是,已經(jīng)有一些聚集性H7N9病例被證實(shí)[18-20],在每起聚集性疫情中,僅有2～3個(gè)確診病例,未有3代病例出現(xiàn)。蘇州在第五波H7N9疫情中也發(fā)現(xiàn)了一起家庭聚集性病例,與之前的聚集性疫情相似,僅1對(duì)有血緣關(guān)系的父女兩人被確診感染H7N9病毒,其他密切接觸者均未感染,表明H7N9病毒僅具有有限的人傳人能力。

本研究初步討論了蘇州市第五波H7N9病毒疫情的流行情況及病毒HA基因的分子特征?？傊?人感染H7N9病毒是散發(fā)事件,絕大多數(shù)病例之間沒(méi)有流行病學(xué)聯(lián)系?；蚍治霰砻鞑《镜膫鞑ツＪ讲⑽窗l(fā)生改變,但是為有效應(yīng)對(duì)潛在的大流行,仍有必要密切監(jiān)測(cè)病毒可能出現(xiàn)的變異并進(jìn)行深入研究。

利益沖突無(wú)