袁婷蘭，朱雯婷，陳先鑫，劉文強，朱雪梅*，熊 華

穩(wěn)定的水包油乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，由于乳液具有較大的界面面積，容易發(fā)生氧化，同時容易發(fā)生絮凝、聚集、分層等物理失穩(wěn)現(xiàn)象，嚴重地影響了食品品質(zhì)和安全；因此多采用往乳液中添加抗氧化劑的方法來增強乳液的穩(wěn)定性[1]。人工合成的抗氧化劑由于食品安全問題逐漸被限制使用，而具有安全性和較強功能特性的天然抗氧化劑越來越廣泛地應(yīng)用于食品乳液體系中[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)在乳液中除其本身表現(xiàn)的抗氧化能力之外，還能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用增強乳液的抗氧化性[3-4]。木犀草素是一種天然黃酮，屬弱酸性四羥基黃酮類化合物，在植物界分布較廣，具有抗氧化、消炎、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性[5-6]。然而木犀草素由于含有酚羥基等基團，脂溶性較差、微溶于水，在乳液體系中的物理分布存在很大的不確定性，極大地限制了其在食品乳液中的應(yīng)用[7]。木犀草素所具有的多羥基結(jié)構(gòu)不僅決定了該物質(zhì)具有強的抗氧化特點，而且能與其他大分子物質(zhì)的特征官能團發(fā)生相互作用而生成新物質(zhì)。乳清蛋白在食品乳液中常作為乳化劑[8]，因其較高的營養(yǎng)價值、安全性及良好的表面活性可成為木犀草素理想的載體。當木犀草素與蛋白質(zhì)分子鍵合[9]，形成乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物，可有效提高其水溶性、穩(wěn)定性和生物利用率。由于蛋白質(zhì)具有較強的表面活性，能夠定向吸附到乳液的界面，當形成乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物后，木犀草素也可能定向聚集在乳液的界面，有效抑制乳液氧化。

此外，在食品加工過程中的熱處理可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，可能會影響蛋白質(zhì)和木犀草素的相互作用，導(dǎo)致吸附效率的提高和聚集體的形成。因此，本實驗探究天然乳清蛋白和熱處理后的乳清蛋白乳液在加入不同質(zhì)量濃度木犀草素后，對于乳液物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性的實際影響和作用規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油為市售；乳清分離蛋白（蛋白質(zhì)量分數(shù)91%～92%） 愛爾蘭Glanbia公司；木犀草素 美國Sigma公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS 224S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GYB 30-6S高壓均質(zhì)機 上海東華高壓均質(zhì)機廠；Zetasizer Nano ZS90激光納米粒度儀 英國馬爾文公司；JB-3型磁力攪拌器、PHS-3精密pH計 上海雷磁新徑儀器有限公司；T6紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；Ultra Turrax T25高速分散機德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 木犀草素和乳清蛋白相互作用的表征

配制乳清蛋白母液和熱處理乳清蛋白母液，濃度為3×10-5mol/L，其中一組乳清蛋白分散液在95 ℃水浴條件下加熱35 min，隨后迅速置于室溫下冷卻，得到熱處理乳清蛋白溶液；配制木犀草素母液濃度為7.2×10-4mol/L。

蛋白質(zhì)內(nèi)源光譜的測定[10]：將乳清蛋白母液的濃度稀釋為3×10-7mol/L，準確移取3.0 mL該稀釋溶液于石英熒光池中，用可調(diào)式移液器逐次加入一定體積木犀草素溶液（藥物的累加體積不超過0.096 mL），木犀草素濃度的變化范圍為0.0～8.4×10-6mol/L，混合均勻并靜置8 min。固定激發(fā)波長為280 nm，熒光發(fā)射光譜掃描范圍為300～500 nm，熒光激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，在熒光光度計上記錄熒光發(fā)射光譜。根據(jù)Stern-Volmer方程（式（1））[11]得出Kq。

式中：F0為不添加木犀草素時的熒光強度；F為添加木犀草素后的熒光強度；Kq為分子猝滅過程速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為未添加木犀草素時的熒光壽命（10-8s）；c為添加木犀草素濃度/（mol/L）。

1.3.2 乳液的制備

用10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液溶解乳清蛋白，制備兩組質(zhì)量分數(shù)為1%的分散液，然后于室溫下磁力攪拌5 h，溶解充分后在4 ℃的環(huán)境下水化12 h，使乳清蛋白充分溶解。

第2天將分散液從冰箱取出。一組不作處理；另外一組待其恢復(fù)到室溫后，95 ℃水浴加熱35 min，隨后迅速置于室溫下冷卻。然后向兩組分散液中加入不同質(zhì)量濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL）的木犀草素，并在室溫下攪拌6 h，使其充分反應(yīng)，以形成蛋白質(zhì)-木犀草素復(fù)合物，然后分別向上述2 組含有蛋白質(zhì)-木犀草素復(fù)合物的溶液中加入體積分數(shù)10%玉米油，12 000 r/min高速分散機分散100 s，再經(jīng)40 MPa高壓均質(zhì)90 s。制備好的乳液用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，待用。

1.3.3 乳液平均粒度和Zeta電位的測定

用磷酸緩沖溶液將新制備的乳液稀釋100 倍，采用Zetasizer Nano ZS90激光納米粒度儀測定各組乳液粒度和Zeta電位。

1.3.4 乳液穩(wěn)定性的測定

穩(wěn)定性測定參考盧錦麗[12]的方法，室溫條件下將上述乳液經(jīng)蒸餾水稀釋1 000 倍后，通過紫外-可見分光光度計測得乳液在400、800 nm波長處的吸光度，用吸光比（specific absorptivity，SRI）A800nm/A400nm表征乳液的穩(wěn)定性，當SRI＜0.3時乳液較為穩(wěn)定。

1.3.5 乳液界面蛋白質(zhì)量濃度和木犀草素質(zhì)量濃度的測定

乳液界面吸附蛋白質(zhì)量濃度的測定根據(jù)Shao Yun等[13]的方法并稍作改動。將1 mL乳液在25 ℃、15 000 r/min離心50 min，然后用注射器轉(zhuǎn)移離心后乳液的水層，并通過0.22 μm的水系微孔濾膜。濾液蛋白質(zhì)量濃度采用Lowry法測定。將用于乳液制備的初始蛋白質(zhì)分散液在同樣條件下離心，同理測定蛋白質(zhì)量濃度。

另取1 mL乳液于小離心管，25 ℃、15 000 r/min離心50 min，過膜，采用紫外-可見分光光度計測濾液在349 nm波長處的吸光度[14]，木犀草素質(zhì)量濃度由木犀草素標準曲線（y＝12.696x+0.455 8，R2＝0.998 2）計算。

1.3.6 乳液的熱耐受性和貯存穩(wěn)定性

熱耐受性：將一定量放置于密閉玻璃試管中的乳液分別在55 ℃和95 ℃水浴中加熱35 min，冷卻至室溫。未經(jīng)熱處理乳液為空白對照組。定期測量其粒徑，觀察其穩(wěn)定性。

貯存穩(wěn)定性：將乳液置于45 ℃的烘箱16 周，定期測量其粒徑，觀察其長期貯存穩(wěn)定性。

1.3.7 乳液氫過氧化物的測定

將樣品置于45 ℃烘箱中加速氧化，并于1、3、6、11、13、15、19、22 d拿出分裝小樣進行氧化實驗的測定。過氧化值采用硫氰化鐵法測定，參考Kargar等[15]的方法。以不添加乳液的一組為對照。

1.3.8 次級氧化產(chǎn)物——丙二醛含量的測定

丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法，由Zhao Qiang等[16]的方法稍作改動。將1 mL去離子水、2 mL硫代巴比妥酸試劑混合于15 mL試管中，漩渦30 s后沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫，然后2 500 r/min離心20 min，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，測定上清液在532 nm波長處的吸光度。樣品中TBARS值可以通過1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有樣品重復(fù)測定3 次，取平均值，采用Origin 8.0和SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，樣品平均值之間的差異性通過Duncan法比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素和乳清蛋白的相互作用

由于生物大分子具有熒光發(fā)色團，實驗通過內(nèi)源熒光光譜檢測基于微環(huán)境的極性變化而導(dǎo)致的熒光發(fā)色團結(jié)構(gòu)變化來分析乳清蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化[17]。對加入不同濃度木犀草素的乳清蛋白乳液進行掃描，得到的熒光光譜圖見圖1。

圖1 乳清蛋白的熒光發(fā)射光譜Fig. 1 Fluorescence emission spectra of whey protein

由圖1可知，隨著木犀草素濃度的不斷增加，乳清蛋白在340 nm波長左右的熒光發(fā)射峰強度逐漸降低，說明木犀草素分子的存在降低了芳香氨基酸殘基間的能量傳遞，其與芳香族氨基酸的相互作用導(dǎo)致乳清蛋白熒光強度的猝滅。且添加木犀草素后，乳清蛋白的熒光發(fā)射峰從340 nm藍移到334.6 nm，熱處理乳清蛋白的發(fā)射峰從345 nm藍移到340.2 nm，表明木犀草素與蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用[9]。張志恒等[9]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清白蛋白分子（human serum albumin，HSA）的熒光強度也隨木犀草素濃度增加而不斷降低，而且HSA的熒光發(fā)射峰的峰位出現(xiàn)了藍移，說明木犀草素與HSA發(fā)生了相互作用。此外，對比乳清蛋白和熱處理乳清蛋白的熒光發(fā)射峰，可以看出，熱處理后乳清蛋白的發(fā)射峰從340 nm紅移到345 nm，表明加熱使其所處環(huán)境的疏水性降低，氨基酸殘基更多暴露于極性微環(huán)境中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)伸展程度可能有所增加[10]。

乳清蛋白和熱處理乳清蛋白的Kq值分別為4.83×1012L/（mol·s）和7.4×1012L/（mol·s），遠大于最大擴散碰撞猝滅常數(shù)（一般認為為2×1010L/（mol·s）），也說明乳清蛋白與木犀草素發(fā)生了靜態(tài)猝滅，形成了復(fù)合物[18]。

2.2 乳液的Zeta電位分析

由圖2可知，所有乳液的液滴Zeta電位表現(xiàn)為負值，與其理論帶有的電荷類型相吻合，表明油-水界面上分子間的排斥力大于吸引力（主要是疏水性和范德華力）[19]。所有乳液的電位介于-40～-45 mV之間，表明乳液系統(tǒng)較穩(wěn)定。此外，木犀草素的質(zhì)量濃度對天然組乳液的電位沒有顯著影響，而加熱組乳液，木犀草素質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的乳液電位的絕對值最低，質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的乳液其電位絕對值高于其他乳液，此時由乳清蛋白與木犀草素復(fù)合物穩(wěn)定的乳液中蛋白質(zhì)分子間的排斥力加強。加熱使乳清蛋白結(jié)合木犀草素分子數(shù)量不同，表面所帶電荷量不同，可能由于加熱處理的蛋白柔性區(qū)域、構(gòu)象不同，這樣通過靜電相互作用所結(jié)合分子的能力不同。

圖2 乳液的Zeta電位Fig. 2 Zeta potential of emulsions

2.3 乳液的SRI分析

圖3 乳液的SRIFig. 3 SRI of emulsions

由圖3可知，所有乳液的SRI值介于0.16～0.18之間，加熱組中加入不同質(zhì)量濃度木犀草素的乳清蛋白乳液，其SRI值沒有顯著的變化。表明本實驗中乳液物理穩(wěn)定較好，再次說明乳液可以在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定而不會出現(xiàn)乳液的絮凝、聚結(jié)、分層等失穩(wěn)現(xiàn)象，與前述電位的結(jié)果吻合。

2.4 乳液界面蛋白質(zhì)量濃度以及界面木犀草素質(zhì)量濃度

蛋白質(zhì)在O/W乳液結(jié)構(gòu)中的物理位置和取向分布與乳液的穩(wěn)定性有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)可以通過靜電效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)使得乳液保持較長時間的穩(wěn)定[13]。木犀草素作為一種抗氧化劑，在油-水界面上更為有效，其抑制油脂氧化的作用與氧化通路上的化合物之間的反應(yīng)相關(guān)[16]。由圖4A可知，乳清蛋白熱處理后，其在不同質(zhì)量濃度木犀草素乳液的界面吸附量都低于相應(yīng)未經(jīng)過熱處理蛋白質(zhì)在乳液界面吸附量。木犀草素質(zhì)量濃度為0.20、0.40 mg/mL的乳液界面蛋白質(zhì)量濃度有顯著差異，表明加熱處理和木犀草素的質(zhì)量濃度均會會影響乳清蛋白與木犀草素的復(fù)合。而由圖4B可知，對于天然組乳液，隨著木犀草素質(zhì)量濃度增加，分別有12%、40%、30%、43%的木犀草素吸附在乳液界面；對于熱處理乳液，相對應(yīng)的有18%、33%、42.5%、45.5%的木犀草素吸附在乳液界面，這說明蛋白質(zhì)的熱處理可以提高木犀草素在乳液界面的吸附。蛋白質(zhì)熱處理后，由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，形成了疏松多孔的結(jié)構(gòu)[1]，推測木犀草素更易與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)并形成復(fù)合物，但是蛋白質(zhì)在乳液的界面吸附并沒有發(fā)生明顯的改變，即蛋白質(zhì)并沒有從乳液界面中替換出來?？梢酝茰y本研究中蛋白質(zhì)與木犀草素形成復(fù)合物后，二者產(chǎn)生協(xié)同作用，使得蛋白質(zhì)和木犀草素都能吸附在乳液界面，而不發(fā)生排斥現(xiàn)象。蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)在乳液的界面吸附是一個多因素影響的復(fù)雜過程，其作用機理和方式還有待于進一步的研究探討。

圖4 乳液的界面蛋白質(zhì)量濃度（A）和界面木犀草素質(zhì)量濃度（B）Fig. 4 Interfacial protein content (A) and luteolin content (B) of emulsions

2.5 乳液的穩(wěn)定性和熱耐受性

表1 45 ℃條件下乳液的粒徑變化Table 1 Evolution of the droplet size of emulsions druing storage at 45 ℃

乳液置于45 ℃環(huán)境下貯存16 周的粒徑變化趨勢見表1。貯存16 周后，乳液的粒徑都有不同程度的增加。對于天然乳液，木犀草素質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的乳液粒徑增加至424.65 nm，其他乳液16 周后的粒徑都集中在360～380 nm。對于熱處理蛋白乳液，除了木犀草素質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的乳液，其他蛋白乳液的粒徑集中于300～330 nm之間，說明木犀草素在高質(zhì)量濃度時可能會引起乳液一定程度的聚集，導(dǎo)致乳液粒徑增加。對比貯藏16 周的天然乳液和熱處理蛋白乳液，可以看出，除了木犀草素質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的乳液，所有熱處理蛋白乳液的粒徑比相應(yīng)天然組乳液的粒徑小。綜合前述界面蛋白和界面木犀草素的實驗結(jié)果，可能是由于蛋白質(zhì)熱處理后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]，雖然界面蛋白質(zhì)量濃度有所降低，但是由于其乳化性得到增強，抵消了蛋白質(zhì)量濃度減少的劣勢；此外，可能由于更多的木犀草素容易吸附在熱處理蛋白乳液的界面，可以增加界面膜的厚度、強度和空間位阻，因此乳液較穩(wěn)定。

崔健等[21]研究結(jié)果表明乳清分離蛋白乳液有較高的熱穩(wěn)定性。為了評價加入木犀草素的乳清蛋白乳液的熱耐受性，本實驗還測定了在室溫環(huán)境下、55 ℃和95 ℃貯存8 周后乳清蛋白穩(wěn)定的乳液的粒徑變化趨勢（數(shù)據(jù)未列出）。所有新制乳液的粒徑基本相同，介于260～290 nm之間，無顯著性差異（P＞0.05），貯存8 周后，乳液粒徑基本保持不變，而且乳液平均粒徑及分布在55 ℃和95 ℃貯存8 周過程中沒有明顯變化，也說明乳清蛋白乳液具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 乳液的氧化穩(wěn)定性

圖5 木犀草素對乳液的過氧化值的影響Fig. 5 Effect of luteolin on POV of emulsions

圖6 木犀草素對乳液的TBARS值的影響Fig. 6 Effect of luteolin on TBARS value of emulsions

由圖5、6可以看出，加入木犀草素后乳液的過氧化值和TBARS值明顯減小，結(jié)果表明木犀草素在該體系中具有抗氧化活性[23]。脂質(zhì)氫過氧化物降解形成高活性自由基是脂質(zhì)氧化的主要原因，脂質(zhì)氫過氧化物的兩親性決定了其主要定位于油-水界面[24-25]，乳液中木犀草素較高的抗氧化效率，再次證明抗氧化劑木犀草素有效的集聚在氧化反應(yīng)發(fā)生最頻繁的O/W界面。

如圖5A、B所示，兩組乳液過氧化值變化趨勢基本一致，未加入木犀草素時，乳液的過氧化值在貯藏期間呈顯著的上升趨勢，貯藏18 d后，天然組和加熱組乳液過氧化值分別達到了26.71 mmol/kg，21.69 mmol/kg。而含木犀草素的乳液過氧化值隨著時間的延長緩慢增加，貯藏的前3 d，乳液的過氧化值先不斷增加，然后隨著貯藏時間的延長其過氧化值緩慢減小，直至13 d后乳液的過氧化值有所增加。貯存18 d后，加入木犀草素質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL，天然組乳液過氧化值分別為5.59、2.47、1.04、3.28 mmol/kg，其加熱組過氧化值分別為4.15、3.39、3.89、4.26 mmol/kg。木犀草素作為從天然植物中提取出來的抗氧化劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有多個酚羥基，具有很強的提供氫原子的能力[26]，而油脂氧化過程中的脂肪酸自由基能與這些氫原子結(jié)合，被轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的惰性化合物，中止了油脂的氧化鏈式反應(yīng)，從而起到抑制脂質(zhì)自動氧化的作用[27]。此外，對比天然組和加熱組，未加入木犀草素的乳液，其加熱組過氧化值明顯低于天然組的，而加入木犀草素的加熱組乳液也表現(xiàn)出過氧化值更低的趨勢，這說明乳清蛋白熱處理后，由于其間空間結(jié)構(gòu)展開、巰基等的暴露[20,22]，使其抑制油脂初級氧化的能力有所提高，其吸附更高質(zhì)量濃度的木犀草素有助于抑制氧化。

由圖6可知，乳液TBARS值的變化趨勢和過氧化值基本一致。未加入木犀草素的乳液TBARS值增長最快，乳液加入木犀草素后，乳液的TBARS值顯著降低，乳液的次級氧化得到明顯抑制，氧化穩(wěn)定性增強[28-29]，說明木犀草素在乳液中具有抗氧化效能。此外，對比天然組和加熱組未加入木犀草素的乳液，可以看出加熱組的TBARS值顯著高于天然組的，與乳液的初級氧化結(jié)果不同。TBARS值反映丙二醛的含量，但是氫過氧化物分解后除生成丙二醛以外還有更多的羰基化合物[30]，這說明乳清蛋白熱處理后其自身抑制丙二醛生成的能力下降，但是熱變性的乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物的TBARS值總體趨勢低于天然乳清蛋白-木犀草素組；因此猜測木犀草素的抗丙二醛生成的能力強，可以抵消熱變性對乳清蛋白的影響，需要后期進一步實驗證明熱變性的乳清蛋白、熱變性乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物、天然乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與其抗氧化活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

3 結(jié) 論

本實驗研究了天然蛋白和熱處理蛋白2 種乳清蛋白與木犀草素之間的相互作用形成不同的蛋白質(zhì)-木犀草素基態(tài)復(fù)合物對于乳液的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：1）熒光光譜顯示木犀草素和乳清蛋白發(fā)生了靜態(tài)猝滅相互作用，生成了基態(tài)復(fù)合物。2）乳液的電Zeta位分析和SRI測定結(jié)果表明蛋白質(zhì)熱處理和木犀草素質(zhì)量濃度對于乳液的物理穩(wěn)定性未產(chǎn)生明顯的影響。3）蛋白質(zhì)熱處理后，其在乳液的界面吸附量都低于相應(yīng)未經(jīng)過熱處理蛋白質(zhì)在乳液的界面吸附量，而木犀草素的質(zhì)量濃度對界面蛋白質(zhì)量濃度未產(chǎn)生明顯影響；木犀草素在乳液界面的吸附含量隨著木犀草素質(zhì)量濃度的增加而提高，蛋白質(zhì)的熱處理在一定程度上可以提高木犀草素在乳液界面的吸附。4）乳液氧化穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，木犀草素的添加顯著提高乳清蛋白乳液的氧化穩(wěn)定性。后期需要更多實驗證明熱變性與否對的乳清蛋白自身結(jié)構(gòu)的影響、對乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響，解釋熱變性乳清蛋白-木犀草素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與其抗氧化活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

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