劉曉佳，薛耀碧，周雅涵，姚世響，鄧麗莉,2，曾凱芳,2,*

柑橘是世界第一大類水果，因其營養(yǎng)豐富、色香味兼優(yōu)而深受消費者喜愛。然而，柑橘果實在采后貯藏、運輸過程中容易受病原菌侵染而發(fā)生霉變、腐爛現(xiàn)象，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。其中，青霉病、綠霉病、炭疽病、酸腐病、蒂腐病是柑橘果實采后最為普遍和最嚴(yán)重的侵染性病害。目前，人們對于柑橘果實采后侵染性病害最為主要的控制手段是使用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)殺菌劑的長期大量使用會引發(fā)病原菌抗藥性、控病效果下降、農(nóng)殘超標(biāo)、環(huán)境污染等一系列問題[1-3]。因此，尋求一種新型的、安全的、可替代或減少化學(xué)殺菌劑的病害防治方法十分必要。近年來，利用誘抗劑誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性成為果蔬采后控制病害研究的熱點[4-6]。苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）是其中一種，它在離體條件下并無殺菌作用，但可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[7]。目前BTH在植物控病方面應(yīng)用較多，但在采后果蔬控病方面應(yīng)用較少[8]。從現(xiàn)有的研究報道來看，BTH處理能夠誘導(dǎo)鴨梨果實產(chǎn)生抗病性，有效降低了鴨梨果實采后青霉病的發(fā)生[9]。BTH處理降低了草莓果實貯藏過程中的灰霉病發(fā)病率[10]。另外，也有關(guān)于BTH處理在蘋果[11]、杏[12]、甜瓜[13]等水果的抗病方面研究的報道。但BTH處理對柑橘果實采后青霉病、綠霉病、炭疽病等病害的相關(guān)研究卻鮮見報道。許多研究表明，包括β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）在內(nèi)的一些防御酶在植物抵御病原菌侵染過程中起著重要作用[14]。內(nèi)源水楊酸在植物抗病性反應(yīng)中充當(dāng)一個重要信號分子的角色，對植物的抗病性起著重要的作用[15-17]。因此，本實驗主要采取不同濃度的BTH與柑橘青霉菌（Penicillium italicum）、綠霉菌（Penicillium digitatum）、炭疽菌（Colletotrichum gloeosporides）對柑橘果實進行同孔、異孔接種，觀察BTH誘抗劑對柑橘果實青霉病、綠霉病、炭疽病的控制效果，篩選出針對這3 種病害控病效果最好的BTH濃度，在此濃度下考察兩種處理方式（打孔和浸泡）對柑橘果實果皮抗病性相關(guān)酶活力和內(nèi)源水楊酸含量的影響，為BTH在柑橘果實采后病害防治上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗采用‘豐臍’柑橘（Citrus sinensis L. Osbeck）果實，采自重慶北碚槽上金竹林果園。果實達到商業(yè)成熟采摘標(biāo)準(zhǔn)（固酸比為11.55±0.49）時進行人工采摘，采后直接運往實驗室，挑選無病蟲害、無機械傷且大小、色澤、果形和成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實作為試材。

P. italicum、P. digitatum、C. gloeosporioides為實驗室自行分離、鑒定和保存菌種。

BTH（分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1000紫外-可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；SYNERGYH1MG全自動酶標(biāo)儀 美國BioTeK公司；3H16R1冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療器械廠；WH-2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；DW-FL270超低溫冷凍存儲箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備

將病原菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于25 ℃下培養(yǎng)7 d后（C. gloeosporioides需28 ℃下培養(yǎng)15 d，使病原菌長出粉紅色孢子），用無菌水將孢子洗下，4 層紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，最后用無菌水將菌懸液稀釋至1×104spores/mL（C. gloeosporides菌懸液濃度為1×105spores/mL），待用。

1.3.2 誘抗劑的制備

BTH用無菌水直接配制，濃度分別為0.25、0.50、1.00 mmol/L，配制過程中加入含體積分?jǐn)?shù)0.01%的Tween-80。

1.3.3 果實處理

果實用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，進行表面消毒后，在自來水下沖洗干凈并于室溫（20～25 ℃）下自然晾干，然后將果實隨機分成24 組（其中同孔實驗12 組，異孔實驗12 組），每組果實3 個，重復(fù)3 次。

1.3.4 BTH誘抗劑濃度的篩選

1.3.4.1 BTH與病原菌同孔損傷接種對柑橘果實采后青霉病、綠霉病和炭疽病的控制效果

損傷接種處理方法參照Zhou Yahan[18]和Usall[19]等方法并作適當(dāng)修改。果實表面赤道部位經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦拭消毒后，用滅菌后的打孔器在果實赤道部位相對位置打2 個孔（深3 mm，直徑6 mm）。然后按照表1所設(shè)計的實驗接種30 μL誘抗劑（對照組接等量無菌水），24 h后分別在每個孔中接種相應(yīng)的菌懸液30 μL。待菌液完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）將果實單果包裝，于20 ℃、相對濕度80%～90%環(huán)境下貯藏。每天觀察果實發(fā)病情況，果實開始發(fā)病時，每天統(tǒng)計病斑直徑和發(fā)病率（接種C. gloeosporioides的果實開始發(fā)病時，每2 d統(tǒng)計一次病斑直徑和發(fā)病率）。

表1 BTH與P. italicum、P. digitatum、C. gloeosporioides在柑橘果實上同孔、異孔損傷接種條件Table 1 Combinations of BTH treatment and pathogen inoculation in the same and different wounds

1.3.4.2 BTH與病原菌異孔損傷接種對柑橘果實采后青霉病、綠霉病和炭疽病的控制效果

接種誘抗劑方法同1.3.4.1節(jié)。果實在接種誘抗劑24 h后在距離原孔2.5 cm處再打一個新孔（深3 mm、直徑6 mm），在這個新孔內(nèi)接種相應(yīng)的菌懸液30 μL。菌液完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋將果實單果包裝，于20 ℃、相對濕度80%～90%環(huán)境下貯藏。每天觀察果實發(fā)病情況，果實開始發(fā)病時，每天統(tǒng)計病斑直徑和發(fā)病率（接種C. gloeosporioides的果實開始發(fā)病時每2 d統(tǒng)計一次病斑直徑和發(fā)病率）。

1.3.5 BTH處理對柑橘果實果皮內(nèi)源水楊酸和抗性相關(guān)酶活力的影響

1.3.5.1 打孔處理

樣品處理及取樣參照Deng Lili[20]、Tang Wanli[21]、Droby[22]等的方法并稍加修改。挑選果形均勻且大小、成熟度一致的果實，用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉浸泡2 min進行表面殺菌后，再用自來水沖洗干凈，室溫下晾干。然后用滅菌的打孔器在果實赤道部位均勻刺6 個孔（深3 mm、直徑6 mm），分別在兩組果實上用微量移液器每孔接種如下液體30 μL：1）無菌水，作為對照組；2）0.50 mmol/L BTH。處理后的果實單果包裝，以報紙覆蓋保濕處理，于20 ℃、相對濕度85%～90%環(huán)境下貯藏，并于貯藏第0、1、2、3、4、7天取孔周圍1 cm的健康果皮組織進行內(nèi)源水楊酸含量和抗性相關(guān)酶活力的測定，每組取樣5 個果實，重復(fù)3 次。

1.3.5.2 浸泡處理

果實分別置于1）無菌水，對照組；2）0.50 mmol/L BTH溶液中浸泡處理2 min。處理后的果實單果包裝，以報紙覆蓋保濕處理，于20 ℃、相對濕度85%～90%環(huán)境下貯藏，并于貯藏第0、7、14、21、28、35天取果實赤道1 cm的果皮組織進行內(nèi)源水楊酸含量和抗性相關(guān)酶活力的測定，每組取樣5 個果實，重復(fù)3 次。

1.3.6 指標(biāo)測定

1.3.6.1 發(fā)病率的測定

發(fā)病率的測定參考Zeng Kaifang等[23]的方法，計算如式（1）所示。

1.3.6.2 病斑直徑的測定

病斑直徑的測定參考Qin Guozheng等[24]的方法，采用十字交叉法測量，單位為mm。

1.3.6.3 內(nèi)源水楊酸含量的測定

內(nèi)源水楊酸含量的測定參考Zhang Yu等[25]的方法，實驗重復(fù)3 次。以鮮質(zhì)量計，單位為ng/g。

1.3.6.4 抗性相關(guān)酶活力的測定

GLU、CHI、PAL、PPO和POD的提取及活力的測定均參考曾凱芳[26]的方法。GLU以每秒鐘每克柑橘果皮組織（鮮質(zhì)量）分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖為1 個酶活力單位（U）。CHI以每秒鐘每克柑橘果皮組織（鮮質(zhì)量）分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol N-乙酰葡萄糖胺為1 個酶活力單位（U）。PAL以每小時每克（鮮質(zhì)量）柑橘果皮組織酶促反應(yīng)體系在290 nm波長處吸光度增加0.01為1 個酶活力單位（U）。PPO和POD活力單位（U）均定義為470 nm波長處吸光度變化1所需的酶量。單位均為U/g。實驗重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計、標(biāo)準(zhǔn)差計算以及制圖均采用Excel 2013軟件；數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）采用SPSS 20.0軟件，利用Duncan’s多重比較對數(shù)據(jù)的顯著性差異進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTH處理對柑橘果實青霉病、綠霉病、炭疽病的控制效果

2.1.1 同孔接種控制效果

圖1 BTH處理對同孔接種病原菌柑橘果實病斑直徑及發(fā)病率的影響Fig. 1 Effect of BTH on lesion diameters and disease incidence in citrus fruits caused by pathogens inoculated in the same wound

由圖1A、B可以看出，柑橘果實青霉病病斑直徑隨貯藏時間延長而增大。與對照組相比（除貯藏第4天），BTH處理均明顯降低了柑橘果實青霉病病斑直徑（圖1A）。貯藏第4天，只有對照組和0.25 mmol/L BTH處理組的柑橘果實發(fā)生了病害，二者之間對比，無顯著性差異。貯藏第5天，所有處理組果實均發(fā)病，從控病效果看，0.50 mmol/L的BTH處理能明顯降低果實青霉病發(fā)病率，其發(fā)病率僅為對照組果實的22.0%（圖1B）。

如圖1C、D所示，隨貯藏時間延長，柑橘果實綠霉病的病斑直徑增加。與對照組相比，不同濃度BTH處理均能降低果實綠霉病病斑直徑（圖1C）。貯藏第4天，所有組果實均開始發(fā)病，BTH處理組與對照組果實病斑直徑存在顯著性差異，但各BTH處理組之間相比，并無明顯差異性。貯藏第5天，果實發(fā)病率都達到100%，從綠霉病斑直徑來看，0.50 mmol/L的BTH處理控病效果最好，此時，其病斑直徑僅為對照組果實的64.0%（圖1D）。

由圖1E、F可知，果實在貯藏第6天開始發(fā)病，除在貯藏第14天，0.25 mmol/L BTH處理與對照相比增加了果實炭疽病病斑直徑外，其余BTH處理均可不同程度降低柑橘果實炭疽病病斑直徑（圖1E）。貯藏第6天，0.50 mmol/L的BTH處理組與其他組之間無論是病斑直徑還是發(fā)病率都存在顯著性差異，其病斑直徑為對照組的50.0%，發(fā)病率為對照組的53.0%（圖1F）。

2.1.2 異孔接種控制效果

圖2 BTH處理對異孔接種病原菌柑橘果實病斑直徑及發(fā)病率的影響Fig. 2 Effect of BTH on lesion diameters and disease incidence of citrus fruits caused by pathogens when inoculated in the different wounds

由圖2A、B可知，各組果實青霉病病斑直徑隨貯藏時間延長增加。貯藏第4天，除1.00 mmol/L BTH處理組的果實未發(fā)病外，其余組果實均開始發(fā)病，對照組與處理組、處理組與處理組果實病斑直徑、發(fā)病率間均無顯著性差異。貯藏第5天，所有濃度的BTH處理均明顯降低了果實的青霉病病斑直徑和發(fā)病率，但不同濃度BTH處理組間并無差異性。貯藏第6天，0.50 mmol/L的BTH處理顯著降低了果實青霉病病斑直徑。

由圖2C、D可知，不同濃度的BTH處理均能降低柑橘果實綠霉病的病斑直徑。貯藏第5天，0.50 mmol/L的BTH處理很好地控制了果實綠霉生長，其病斑直徑為對照組的72.7%。

如圖2E、F所示。貯藏第6天，對照組與處理組果實均開始發(fā)病。不同濃度的BTH處理在整個貯藏過程都能明顯地抑制柑橘果實炭疽病病斑直徑的增加。在貯藏第6～8天，0.50 mmol/L的BTH處理明顯降低了果實炭疽病的發(fā)生，同時其也很好地抑制了果實病斑直徑的增加，與其他處理組之間具有顯著性差異。

綜上所述，0.25、0.50、1.00 mmol/L 3 種濃度的BTH與P. italicum、P. digitatum、C. gloeosporioides同孔或異孔接種均可以降低果實青霉病、綠霉病、炭疽病的病斑直徑，其中，0.50 mmol/L的BTH效果最好；在控制病害發(fā)病率方面，3 種濃度的BTH處理均在果實發(fā)病初期有效果，后期效果不顯著，相比之下，0.50 mmol/L的BTH效果較好。

2.2 BTH處理對柑橘果皮內(nèi)源水楊酸含量的影響

圖3 BTH損傷接種處理（A、B）及浸泡處理（C、D）對柑橘果皮內(nèi)源水楊酸含量的影響.Fig. 3 Effect of BTH wound inoculation (A, B) and dipping treatment(C, D) on endogenous salicylic acid contents in citrus fruit peel

如圖3A所示，損傷接種BTH和無菌水均能使柑橘果實果皮中內(nèi)源游離態(tài)水楊酸含量先增加后降低。與對照組相比，BTH處理顯著提高了內(nèi)源游離態(tài)水楊酸含量的峰值，其峰值為對照組的1.79 倍。在貯藏末期，BTH處理組的內(nèi)源游離態(tài)水楊酸含量顯著高于對照組。由圖3B可以看出，損傷接種BTH后，內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸的含量先升高達到高峰后略有下降，此后繼續(xù)升高，在貯藏第7天達到最大值，其值為對照組的2.81 倍，而對照組的內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量在整個貯藏期間變化都不大。

由圖3C、D可知，浸泡處理的果實中，果皮內(nèi)源游離態(tài)水楊酸和內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量在整個貯藏期間變化都不大。與對照組相比，BTH浸泡處理對果實果皮中內(nèi)源游離態(tài)水楊酸含量無明顯影響，但能夠顯著增加內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量，在貯藏第28天，BTH處理組內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量為對照組的1.26 倍。

2.3 BTH處理對柑橘果皮抗性相關(guān)酶活力的影響

2.3.1 BTH處理對柑橘果皮GLU活力的影響

圖4 BTH損傷接種處理（A）及浸泡處理（B）對柑橘果皮GLU活力的影響Fig. 4 Effect of BTH wound inoculation (A) and dipping treatment (B)on GLU activity of citrus fruit peel

如圖4A所示，損傷接種后，柑橘果皮GLU活力呈先上升后下降的趨勢。與對照組相比，BTH處理能明顯增加柑橘果皮GLU活力，提高其峰值水平，而且在整個貯藏期間，其GLU活力始終高于對照組。

由圖4B可知，與對照組相比，BTH浸泡處理也能顯著增加柑橘果皮GLU活力，并能使GLU活力峰值提前出現(xiàn)，在貯藏第7天，BTH處理組果皮的GLU活力為對照組果實的1.30 倍。

2.3.2 BTH處理對柑橘果皮CHI活力的影響

由圖5A可知，BHT損傷接種可以使柑橘果皮CHI活力呈先上升、后下降再上升、再下降的趨勢。與對照組相比，BTH損傷處理能明顯增加柑橘果皮中CHI活力，使其活力峰值水平提高。在貯藏末期（第7天），BTH處理組CHI活力高出對照組56.4%。

從圖5B可以看出，經(jīng)不同浸泡處理的柑橘果皮在貯藏期間CHI活力呈先上升后降低再升高趨勢。BTH處理組CHI活力總體要高于對照組，貯藏末期，BTH處理組的CHI活力是對照組的1.13 倍。

圖5 BTH損傷接種處理（A）及浸泡處理（B）對柑橘果皮CHI活力的影響Fig. 5 Effect of BTH wound inoculation (A) and dipping treatment (B)on CHI activity of citrus fruit peel

2.3.3 BTH處理對柑橘果皮PAL活力的影響

圖6 BTH損傷接種處理（A）及浸泡處理（B）對柑橘果皮PAL活力的影響Fig. 6 Effect of BTH wound inoculation (A) and dipping treatment (B)on PAL activity of citrus fruit peel

如圖6A所示，與對照組相比，BTH損傷接種處理能明顯增加柑橘果實果皮中PAL活力，使其在整個貯藏期間始終保持較高水平。在貯藏第1、3、4、7天，BTH處理組PAL活力值與對照組間存在顯著性差異。貯藏第4天，BTH處理組的PAL活力為對照組的1.40 倍，貯藏末期（第7天），BTH處理組的PAL活力為對照組的1.31 倍。

由6B圖可得，與對照處理相比，BTH浸泡處理能顯著提高果實果皮中PAL活力，尤其是在貯藏第14天，PAL活力迅速達到高峰，此后雖有所下降，但變化時間較短，在貯藏末期（第21～35天），PAL活力緩慢上升。貯藏第35天，BTH組PAL活力為對照組的1.17 倍。

2.3.4 BTH處理對柑橘果皮POD活力的影響

圖7 BTH損傷接種處理（A）及浸泡處理（B）對柑橘果皮POD活力的影響Fig. 7 Effect of BTH wound inoculation (A) and dipping treatment (B)on POD activity of citrus fruit peel

如圖7A所示，與對照組相比，BTH損傷接種可明顯增加柑橘果皮POD活力。整個貯藏期間（第2天除外），BTH損傷接種果實果皮中POD活力呈先上升后下降的趨勢，在貯藏第4天達到最大值，為此時對照組POD活力的1.63 倍。對照組果實果皮中POD活力在整個貯藏期間呈緩慢上升趨勢直至貯藏末期。

由圖7B可知，與對照組相比，BTH浸泡處理能顯著增加柑橘果實果皮中POD活力。整個貯藏期間對照組果皮POD活力變化不明顯，BTH處理組POD活力在貯藏前期顯著增加，貯藏7～21 d內(nèi)變化不大，在貯藏末期（21～35 d），其POD活力呈先迅速降低后急劇上升，在貯藏第35天，BTH浸泡處理組POD活力為對照組的1.91 倍。

2.3.5 BTH處理對柑橘果皮PPO活力的影響

由圖8A可知，與對照組相比，BTH損傷接種處理能明顯增加柑橘果實果皮中PPO活力。損傷接種后，BTH處理組PPO活力緩慢上升，在貯藏第4天達到峰值，為此時對照組的1.60 倍，此后PPO活力有所降低，但整個貯藏期BTH組PPO活力始終高于對照組。

由圖8B可知，BTH浸泡處理果實后，柑橘果實果皮中PPO活力在貯藏7 d內(nèi)先緩慢上升，達到高峰后緩慢下降，直到貯藏末期，其PPO活力仍顯著高于對照組，說明BTH處理可以增加果實果皮中PPO活力。在貯藏第35天，BTH處理組PPO活力為對照組的1.56 倍。

圖8 BTH損傷接種處理（A）及浸泡處理（B）對柑橘果皮PPO活力的影響Fig. 8 Effect of BTH wound inoculation (A) and dipping treatment (B)on PPO activity of citrus fruit peel

3 討 論

BTH被認(rèn)為是十分有效的植物抗病性誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)多種作物產(chǎn)生抗病性，從而增強其對病原菌的防御能力。然而，在利用BTH誘導(dǎo)不同采后果蔬對不同病害產(chǎn)生抗性時，所需的濃度不同。例如，汪開拓等[27]研究認(rèn)為0.2 g/L BTH處理能有效控制桃果實貯藏期間由Penicillum expansum引起的青霉病。弓德強等[28]研究認(rèn)為利用50 mg/L的BTH水溶液對杧果果實作噴霧處理，能顯著降低杧果果實自然發(fā)病病情指數(shù)。麻寶成等[29]研究認(rèn)為利用5 mmol/L的BTH對香蕉果實進行噴霧處理，能較好地控制其腐爛效果，且能顯著降低果實在貯藏過程中的病情指數(shù)。本實驗結(jié)果表明，適宜濃度的BTH均能誘導(dǎo)柑橘果實產(chǎn)生抗病性，減輕果實青霉病、綠霉病和炭疽病的病害嚴(yán)重程度。在不同濃度BTH對柑橘果實青霉病、綠霉病和炭疽病病斑直徑的控制實驗中：0.25、0.50 mmol/L和1.00 mmol/L的BTH在對柑橘果實損傷接種后，P. italicum、P. digitatum、C. gloeosporioides與其同孔、異孔接種，均能明顯降低青霉病、綠霉病、炭疽病的病斑直徑。其中，0.50 mmol/L的BTH同時對這3 種病害具有最好的控制效果。而在不同濃度BTH對果實3 種病害發(fā)病率控制方面：BTH僅能夠在發(fā)病初期對3 種病害發(fā)病率有所控制，后期并無顯著影響。相比之下，0.50、1.00 mmol/L的BTH控制效果均好于0.25 mmol/L BTH，并且0.50 mmol/L BTH控病效果最好。綜上所述，在實驗所試的3 種濃度中，0.50 mmol/L BTH誘導(dǎo)柑橘果實產(chǎn)生抗病性對青霉、綠霉和炭疽病的控制效果最好。

水楊酸在植物體內(nèi)通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，當(dāng)游離態(tài)水楊酸含量達到一個閾值的時候，則會轉(zhuǎn)換為結(jié)合態(tài)水楊酸。水楊酸作為一種誘導(dǎo)子，其含量水平在植物體內(nèi)與抗病性表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。內(nèi)源水楊酸的積累先于抗病相關(guān)基因表達和抗病性產(chǎn)生[15]。本實驗結(jié)果表明，在柑橘果實上損傷接種BTH，能夠有效地引起柑橘果實果皮中游離態(tài)水楊酸含量的增加，同時也能引起果實果皮中內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量的增加；在BTH浸泡處理實驗中，BTH對柑橘內(nèi)源游離態(tài)水楊酸含量無明顯影響，但能引起內(nèi)源結(jié)合態(tài)水楊酸含量的增加，表明BTH可以誘導(dǎo)柑橘果實產(chǎn)生抗病性。

GLU和CHI是兩種重要的病程蛋白相關(guān)酶[30]。由于真菌細(xì)胞壁中含有β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)，且這兩種酶通常在降解真菌細(xì)胞壁反應(yīng)中表現(xiàn)出協(xié)同作用；因此，如果果實能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩種酶，則通常被認(rèn)為能夠增強對病原菌的抗性。汪躍華等[31]研究認(rèn)為BTH處理能夠提高砂糖橘GLU和CHI活力。本實驗結(jié)果表明，與對照處理相比，BTH處理增加了柑橘果實果皮內(nèi)GLU和CHI活力。PAL、POD、PPO參與了果實總酚、類黃酮、木質(zhì)素等代謝過程。其中，PAL是苯丙烷途徑的限速酶和關(guān)鍵酶，能夠催化苯丙氨酸向肉桂酸轉(zhuǎn)變，進入苯丙烷類代謝途徑，影響植物體內(nèi)阿魏酸、香豆酸、芥子酸等中間代謝產(chǎn)物的生成以及一系列苯丙烷類化合物的合成，是木質(zhì)素誘導(dǎo)合成的起點[32-33]。POD則是木質(zhì)素誘導(dǎo)形成過程中最常見的氧化-還原酶之一，在脫氫酶的參與下，能夠催化許多重要酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而參與木質(zhì)素的合成過程，同時也是細(xì)胞內(nèi)重要的活性氧清除劑[32]。而PPO能夠催化醌類物質(zhì)和單寧類物質(zhì)的生成，醌類物質(zhì)和單寧類物質(zhì)通常對病原菌菌絲的生長產(chǎn)生毒性作用，且酚類物質(zhì)是合成木質(zhì)素的前體物質(zhì)，PPO參與了木質(zhì)素的形成，進而促進細(xì)胞壁木質(zhì)化，使植物對病原菌的抗性增強[32]。因此，以上3 種酶活力的增強對采后果實抗病性的增強具有重要作用。大量研究表明，BTH處理能夠促進相關(guān)果蔬中PAL、POD、PPO活力的增強，進而增強其抗病性[32,34-37]。本研究結(jié)果表明，在損傷接種及浸泡實驗中，BTH處理均能升高柑橘果實果皮中PAL、POD、PPO、CHI和GLU的活力，推測它們參與了BTH誘導(dǎo)柑橘果實對病原菌侵染的抗性反應(yīng)。

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