畢潔 王如剛

外周淋巴細(xì)胞微核胞質(zhì)分裂阻滯細(xì)胞(CB-MNT)是一種微核實驗法[1]，反映細(xì)胞遺傳學(xué)毒性的最敏感指標(biāo)，作為職業(yè)性放射性作業(yè)接觸輻射損傷評價非常有意義的指標(biāo)。微核胞質(zhì)分裂阻滯細(xì)胞法微核實驗已在放射，毒理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用[2]。據(jù)報道, 采用CB-MNT實驗法檢測外周血的淋巴細(xì)胞自發(fā)微核率(MNF)較比常規(guī)法敏感，檢測染色體斷片與落后的準(zhǔn)確率更高[3]，更快速、簡便。對此于2016年 4 月對微核檢測的(CB-MNT)方法學(xué)做進(jìn)一步研究探討，并比較兩種方法檢測的放射人員的淋巴細(xì)胞自發(fā)微核率(MNF)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取參加北京市疾病預(yù)防控制中心(CDC)職業(yè)健康體檢的85名從事放射線作業(yè)的在崗人員，且血、尿、肝腎功能正常者。其中男52名，女43名，18～55歲，平均年齡(37.30±9.25)歲，平均放射工齡為(9.22±10.57)年。分別采用常規(guī)培養(yǎng)法(C-MNT)和微核胞質(zhì)分裂阻滯的2種培養(yǎng)方法檢測微核淋巴細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1儀器： LRH恒溫培養(yǎng)箱，凈化工作臺、冷凍離心機(jī)、顯微鏡系統(tǒng)

1.2.2試劑： 微核培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基)、甲醇、冰醋酸、KCl低滲液、細(xì)胞松弛素B、二甲基亞GIemsa染液、二甲基亞砜(DMSO)。

1.2.3Cyt-B配制： 將Cyt-B用二甲基亞砜(DMSO)配成2 mg/mL的儲存液，-20 ℃保存，用時融化后，生理鹽水稀釋(10∶1)，加入培養(yǎng)基中。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)： 取800 μL靜脈血接種于4 mL RPMI1640中混勻，置于(37±0.5)℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱，常規(guī)法組直接培養(yǎng)72 h收獲；CB法組在細(xì)胞培養(yǎng)至40 h在凈化工作臺中加入Cyt-B松胞素，繼續(xù)培養(yǎng)至68～72 h收獲。

1.2.5制片與染色： 收獲細(xì)胞后，以1 500 r/min離心5 min，棄掉培養(yǎng)上清；加入37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl 5 mL,充分混勻后，立即加入1 mL新鮮配制的甲醇：冰醋酸(3∶1)混勻，低滲預(yù)固定，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加5 mL固定液固定20 min，經(jīng)1 500 r離心，固定20 min，可重復(fù)一次后，離心棄上清液，留沉渣懸液0.5 mL垂直滴片，干燥后進(jìn)行Giemsa染色。制備成完整的淋巴細(xì)胞微核片。

1.3鏡檢指標(biāo) (1)常規(guī)法觀察轉(zhuǎn)化的單核淋巴細(xì)胞[4]；(2)CB法觀察轉(zhuǎn)化雙核淋巴細(xì)胞：此時胞體較大，細(xì)胞漿豐富清晰，雙核是經(jīng)第一次有絲分裂所致，形成位于同一個細(xì)胞內(nèi)兩個獨立且核膜完整的細(xì)胞核[5]，兩核之間有很細(xì)的物質(zhì)相連，不寬于主核直徑的1/4，兩個核的大小接近，染色深淺相同；(3)微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：微核位于已經(jīng)轉(zhuǎn)化的完整細(xì)胞胞漿中，呈圓形或橢圓形，，游離于胞質(zhì)中，或與主核相切，直徑小于主核的1/16～1/3，染色深淺與主核相同或略淺，無折光性；(4)觀察細(xì)胞：高倍鏡40 x計數(shù)CB法計數(shù)500個雙核淋巴細(xì)胞；常規(guī)法計數(shù)1 000個轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，以千分率表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 資料數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用計算每組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用配對樣本t檢驗，顯著性界值P<0.05。

2 結(jié)果

2.1常規(guī)法和CB法制片細(xì)胞形態(tài)比較 常規(guī)法的淋巴細(xì)胞易破裂，細(xì)胞之間界限不清,易堆積；CB法的雙核細(xì)胞胞膜完整，邊界清晰，分散均勻，胞質(zhì)豐富，雙核微核淋巴細(xì)胞胞體膨大，均被染成紫紅色，微核染色略淺，易于辨認(rèn)，圖2 中A圖雙核細(xì)胞中可見2個微核，B、C、D圖中可見 1個微核(圖1和2)。

圖1 常規(guī)法制片：單核淋巴細(xì)胞微核

注：外周血淋巴細(xì)胞微核(Giemsa染色,×40)圖2 CB法制片：雙核淋巴細(xì)胞微核

2.2CB-MNT組 與C-MNT組 培養(yǎng)外周淋巴細(xì)胞微核比較兩組的微核自發(fā)率 MNF具有明顯差異(t=-6.17P<0.01,表1)。

表1 CB-MNT 與C-MNT放射人員微核細(xì)胞自發(fā)率比較

注：MNF 微核細(xì)胞自發(fā)率(‰), CB-MNT法=微核數(shù)/500個CB雙核細(xì)胞,C-MNT法=微核數(shù)/1 000個單核淋巴細(xì)胞。

3 討論

3.1微核制片直接影響微核分析結(jié)果，與微核實驗制片質(zhì)量有關(guān)，如何去除紅細(xì)胞而又保證淋巴細(xì)胞膜的完整性是制片關(guān)鍵。實驗室的低滲溫度選擇25～30 ℃，加入低滲液混勻即刻加入固定液，無需放置一段時間，這樣可破壞大多數(shù)紅細(xì)胞。采用(3∶1)固定液預(yù)固定使淋巴細(xì)胞得到適當(dāng)膨脹并穩(wěn)定,克服了常規(guī)法低滲程度不穩(wěn)定，細(xì)胞有易破碎、形態(tài)不完整和成堆傾向。低滲操作時混勻要輕柔，避免把膨脹的淋巴細(xì)胞弄碎。各步離心后，應(yīng)留存0.5 mL上清，先混勻，再加入各種液體，避免混勻時間過長。

3.2獲得較多數(shù)量的雙核細(xì)胞用于分析，是CB-MN法的關(guān)鍵。實驗室培養(yǎng)40 h，加入Cyt-B濃度為6 g/mL，68 h收獲。獲得了多量(45.0%～64.0%) 雙核細(xì)胞，此時獲得雙核細(xì)胞比例最高，和SURASERANIVONGSE等[6]研究結(jié)果一致。研究推薦誘發(fā)雙核細(xì)胞的Cyt-B最適濃度為6 g/mL[7]，適宜的濃度可以抑制細(xì)胞運動和胞質(zhì)分裂，刺激胞核分裂，影響雙核細(xì)胞的產(chǎn)量。過高或過低可引起雙核細(xì)胞減少或核膜破裂，致無法識別雙核細(xì)胞。且研究顯示Cyt-B本身是一種霉菌Hdd的代謝產(chǎn)物，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，低溫保存(-40～-70 ℃)。Cyt-B在細(xì)胞的有絲分裂中可阻止胞質(zhì)分裂而不影響核分裂，它不是誘變劑，并不會誘發(fā)微核和染色體畸變[8]，微核主要來源于細(xì)胞分裂后期滯后的染色體斷片。實驗證實使用Cyt-B是安全的[9]，對外周微核自發(fā)率無明顯影響。

3.3加入Cyt-B必須準(zhǔn)確，應(yīng)用度量精確的微量加樣器。Cyt-B的配制、儲存與實驗過程中要注意避光，否則容易效價下降，影響雙核細(xì)胞的數(shù)量和完整性。微核胞質(zhì)分裂阻滯細(xì)胞(CB-MNT)方法是檢測微核染色體斷裂或總體染色體丟失的生物學(xué)標(biāo)志物的方法[10]。 目前外周淋巴細(xì)胞微核測定法多采用常規(guī)法和CB法，通過表1常規(guī)法和CB法比較顯示，CB法的微核自發(fā)率明顯高于常規(guī)法，這與相關(guān)報道一致[11]。

3.4因絕大多數(shù)淋巴細(xì)胞完成第1次有絲分裂需要48 h，此時細(xì)胞處于有絲分裂高潮。但常規(guī)法是72 h培養(yǎng)，大部分細(xì)胞已完成2次或以上有絲分裂，此時有絲分裂次數(shù)多，微核已經(jīng)丟失；而CB法在培養(yǎng)40～44 h之間加入試劑松弛素B阻滯胞質(zhì)分裂，松胞素使大部分淋巴細(xì)胞停留在第1次有絲分裂階段，微核不易丟失；常規(guī)法因只能判斷淋巴細(xì)胞是否轉(zhuǎn)化，不能識別第1次有絲分裂細(xì)胞而欠準(zhǔn)確，而胞質(zhì)分裂阻斷法克服了這一不足，獲得大量雙核CB細(xì)胞，較常規(guī)法對毒性物質(zhì)更靈敏，大大提高了微核分析結(jié)果準(zhǔn)確率。

通過研究，可見CB法觀察細(xì)胞僅為常規(guī)法的50%，每個標(biāo)本只需計數(shù)500個雙核淋巴細(xì)胞，且雙核淋巴細(xì)胞胞體膨大，比轉(zhuǎn)化的單淋巴細(xì)胞容易識別，這樣節(jié)約閱片時間，提高工作效率。實驗表明微核胞質(zhì)分裂阻滯細(xì)胞CB-MNT法操作簡便，易于觀察，效率更高，具有良好的可靠性和重復(fù)性，其敏感性及準(zhǔn)確性均優(yōu)于常規(guī)法。CB-MNT已成為一項標(biāo)準(zhǔn)細(xì)則細(xì)胞遺傳學(xué)檢測實驗方法，作為接觸放射作業(yè)人員的必檢項目[12]，在職業(yè)輻射有害環(huán)境對人體遺傳毒性效應(yīng)的評價中，建議實驗室可作為優(yōu)先選擇的實驗方法。

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