王少磊，曹榮升，沈 芳，項(xiàng)興本，顏守保

（安徽迎駕貢酒股份有限公司，安徽霍山237200）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，其中以濃香型白酒為主，濃香型白酒產(chǎn)量占全國(guó)白酒行業(yè)總產(chǎn)量的70%以上[1-3]。濃香型白酒香味成分復(fù)雜、多樣，其主體香味成分為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)，此外，愈創(chuàng)木酚類(lèi)、呋喃類(lèi)、芳香族類(lèi)以及吡嗪類(lèi)化合物也為濃香型白酒的復(fù)合香氣作出了重要貢獻(xiàn)[4-5]。4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-ethyl guaiacol,簡(jiǎn)稱(chēng)4-EG)是愈創(chuàng)木酚類(lèi)的一種，又名4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-ethyl-2-methoxy-pheno1)，分子式為 C9H12O2，為無(wú)色或淡黃色油狀液體，呈發(fā)酵香氣，略帶甜味，微帶酚的氣息。4-乙基愈創(chuàng)木酚是一種天然呈香化合物，對(duì)白酒香氣具有重要的貢獻(xiàn)，它是自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧化和預(yù)防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有預(yù)防疾病、抗衰老、促進(jìn)人體健康的作用[6-8]。通常通過(guò)以下3種方法制備4-乙基愈創(chuàng)木酚，一是從天然木油中精餾，二是由愈創(chuàng)木酚或香莢蘭乙酮人工合成，三是通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，其中精餾提取操作復(fù)雜，成本高；人工合成所需要的反應(yīng)條件比較苛刻，且因需要?jiǎng)《镜匿\汞參與反應(yīng)，難以工業(yè)化；而生物轉(zhuǎn)化法具有周期短、反應(yīng)條件溫和、價(jià)格低廉、無(wú)污染、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已引起各國(guó)研究者的高度關(guān)注[9-10]。在中國(guó)白酒中，4-乙基愈創(chuàng)木酚是呈香組分，而微生物的生物轉(zhuǎn)化是其重要的來(lái)源之一，因此本實(shí)驗(yàn)從濃香型白酒大曲中篩選分離獲得1株4-乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌株，根據(jù)分離菌株生理生化、形態(tài)的研究并結(jié)合16S rDNA序列分析鑒定其種屬關(guān)系，為白酒行業(yè)中4-乙基愈創(chuàng)木酚的生物合成提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：大曲樣品由安徽迎駕貢酒股份有限公司提供。

試劑：2-辛醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚均為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自德國(guó)Dr.E公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

儀器及設(shè)備：滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫7890A-5975C)/高速離心機(jī)等。

1.2 培養(yǎng)基

(1)平板分離培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基的配制(1 L)：稱(chēng)取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂20 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調(diào) pH7.2～7.4，120℃滅菌30 min。

(2)種子液培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基的配制(1 L)：稱(chēng)取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，120℃滅菌30 min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基。麩皮培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)：麩皮5 g，加水95 mL，混勻分裝后，以115℃濕熱滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)條件

種子液培養(yǎng)條件：從新鮮斜面上挑取數(shù)環(huán)菌落至LB培養(yǎng)基中（每250 mL搖瓶裝100 mL培養(yǎng)基），于37 ℃、160 r/min下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：將培養(yǎng)好的種子液，按5%的接種量（v/m）接入麩皮培養(yǎng)基(每250 mL搖瓶裝100 g培養(yǎng)基)中，于37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)。

1.4 產(chǎn)4-EG菌株篩選方法

1.4.1 產(chǎn)4-EG菌株的篩選

稱(chēng)取5 g大曲，研磨成粉末，加入裝有95 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，振蕩打散后，再將獲得的懸液按10倍梯度稀釋到10-6，取各稀釋液0.1 mL，分別涂布LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落經(jīng)劃線分離為純菌落，接種于LB培養(yǎng)基瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24 h后4℃保藏備用。

1.4.2 產(chǎn)4-EG菌株的復(fù)篩

分離菌株經(jīng)活化后，分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37℃、160 r/min)6 d后，過(guò)濾發(fā)酵液，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，4-EG為外標(biāo)，通過(guò)GC-MS檢測(cè)揮發(fā)組分中4-EG含量。

1.5 菌株鑒定的形態(tài)特征與鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)特征

(1)對(duì)分離到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體在固體平板上的形態(tài)、顏色、黏稠度、光澤度、菌落邊緣隆起情況、菌落的透明度等菌落特征，并在電子顯微鏡下觀察菌體的顯微形態(tài)。

(2)將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液涂布于無(wú)菌一次性塑料平板上，在無(wú)菌工作臺(tái)上自然晾干后，用無(wú)菌手術(shù)刀將平板切成1 cm×1 cm的小方塊，用1%戊二醛于4℃冰箱中固定1 h，用磷酸緩沖液（PBS）沖洗2次，于4℃冰箱中，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脫水各5 min，最后自然干燥。將所制樣品放置于銅片上，于SPI-Module control設(shè)備中鍍金，然后將樣品放于掃描電鏡樣品室中抽真空，掃描成像。

1.5.2 菌株的部分生理生化特性鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版[11]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行了一系列生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，包括接觸酶、氧化酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、木糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、半乳糖、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶、淀粉水解、脂肪水解和明膠水解等。

1.5.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

(1)目標(biāo)菌株的基因組總DNA提取

菌體制備和裂解：2 mL新鮮菌體培養(yǎng)液，12000 r/min、4 ℃離心5 min，1 mL TE重懸，洗滌并離心；加溶菌酶至100 μg/mL終濃度，37℃下保持1 h至溶液變清；加10%SDS至2%終濃度，加蛋白酶K至100 μg/mL終濃度，50℃下保持3 h。

DNA抽提：加1/3體積的飽和NaCl，劇烈振蕩15 s，以4 ℃、12000 r/min 離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入5 mL離心管中；用等體積的酚、氯仿、異戊醇抽提2次，再用氯仿抽提2次，取上清液。

DNA沉淀：上清液加入等體積異戊醇沉淀DNA，室溫放置30 min后，12000 r/min離心15 min，取下層沉淀，用70%vol乙醇洗滌3次，晾干加30～50 μL雙蒸水或TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)目標(biāo)菌株的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增

16S rDNA序列分析法是目前細(xì)菌種屬鑒定中常用的快速分子生物學(xué)方法，采用16S rDNA擴(kuò)增通用引物，以目標(biāo)菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物27F(5'-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3'),1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')，上海生工生物公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：

10×Taq buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10 mM dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL，primer(10 mmol/L）各2.5 μL，Taq polymerase 0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 13 μL。

PCR反應(yīng)條件：

（3）目標(biāo)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

16S rDNA測(cè)序由上海生物工程技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果采用Chromas參照正反序列圖譜人工校對(duì)。校正后的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列BLAST比對(duì)。采用Clustal X1.8對(duì)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的模式菌株以及試驗(yàn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)(Aligment)后，采用BioEdit手工刪除兩端不齊序列，再用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1000次bootstraps檢驗(yàn)計(jì)算支持率。

1.6 4-EG分析方法

(1)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280℃；程序升溫：初始柱溫65℃，保持3 min，以5℃/min升溫至150℃，保持2 min，再以10℃/min升溫至280℃，保持4 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速0.8 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI；監(jiān)測(cè)方式：全掃描模式，質(zhì)量范圍45～600 amu；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；溶劑延遲：3 min。

(2)定量分析

以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，4-EG為外標(biāo)，將樣品中4-EG的峰面積與內(nèi)標(biāo)2-辛醇的峰面積之比，和標(biāo)準(zhǔn)品中4-EG的峰面積與內(nèi)標(biāo)2-辛醇的峰面積之比相互比較，計(jì)算出樣品中4-EG的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 4-EG產(chǎn)生菌株的篩選

將大曲樣品經(jīng)過(guò)多次稀釋和劃線分離，根據(jù)平板上菌落的形態(tài)、顏色、黏稠度、光澤度、菌落邊緣隆起情況、菌落的透明度等菌落特征，初步篩選分離獲得16株菌株，從形態(tài)上判斷均為細(xì)菌，分別將這些菌株進(jìn)行產(chǎn)4-EG試驗(yàn)。利用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性組分，以揮發(fā)性組分中的4-EG含量為基準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)篩選獲得1株4-EG產(chǎn)量較高的菌株(見(jiàn)表1)，該菌株(EG06)4-EG產(chǎn)生量可達(dá)32.89 μg/g發(fā)酵產(chǎn)物。因此，選取該菌株作進(jìn)一步的菌種鑒定。

表1 產(chǎn)4-EG菌株的初篩結(jié)果

2.2 菌株EG06的鑒定

2.2.1 菌株EG06的形態(tài)學(xué)特征和部分生理生化鑒定

菌株EG06革蘭氏染色陽(yáng)性，在平板上菌落呈圓形，中央隆起，表面光滑細(xì)密，中等濕度，邊緣整齊，乳白色不透明，不產(chǎn)生色素(見(jiàn)圖1A)。液體培養(yǎng)基中無(wú)菌膜,菌液渾濁,有沉淀產(chǎn)生。在電子顯微鏡下，細(xì)胞為桿狀，菌體直徑為1.5～2.3 μm。單一、成對(duì)或形成小叢集(見(jiàn)圖1B)。

菌株EG06能夠在10～45 ℃，pH3～8，NaCl小于8%的條件下生長(zhǎng)。發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，但不能發(fā)酵木糖。氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和脂肪水解試驗(yàn)為陽(yáng)性；苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和尿素水解試驗(yàn)陰性。依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，發(fā)現(xiàn)菌株EG06有芽孢桿菌屬的典型特征，因而可以初步確定為芽孢桿菌，還需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定。

2.2.2 菌株EG06的分子生物學(xué)鑒定

獲得EG06基因組總DNA后，以總DNA為模板，引物為16S rRNA通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA部分序列。擴(kuò)增后得到大約1700 bp目的片段(見(jiàn)圖2)。

圖2 菌株EG06的16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

利用16S rDNA通用引物測(cè)序，結(jié)果表明菌株EG06的16S rDNA目的片段核苷酸序列全長(zhǎng)約1578 bp。采用NCBI提供的BLAST程序?qū)⒃撔蛄信cGenebank中已注冊(cè)的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的幾個(gè)種之間同源性均達(dá)到98%。因此，可以判斷該菌株屬于芽孢桿菌屬。

采用ClustalX1.8對(duì)GenBank中的已知序列以及測(cè)得的序列進(jìn)行比對(duì)后，采用BioEdit手動(dòng)刪除兩端不齊序列，再用MEGA5.0采用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖3)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明菌株EG06與芽孢桿菌屬多株菌株的進(jìn)化親緣關(guān)系很近，并且Bootstrap檢驗(yàn)也達(dá)到了100%，因此，結(jié)合EG06的形態(tài)學(xué)和生理生化特征，該菌株應(yīng)是芽孢桿菌屬中的一個(gè)種，為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名為Bacillus amyloliquefaciens EG06。

2.3 代謝產(chǎn)物分析

將菌株Bacillus amyloliquefaciens EG06接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min培養(yǎng)6 d后過(guò)濾發(fā)酵液，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)GC-MS檢測(cè)發(fā)酵液中揮發(fā)性組分并對(duì)其半定量。發(fā)酵上清液經(jīng)GCMS檢測(cè)，檢測(cè)出23種揮發(fā)性組分，如亞麻酸乙酯、2，3-丁二醇、異丁酸、異辛酸、4-EG、1-石竹烯、油酸乙酯等(見(jiàn)圖4)。其中，酯類(lèi)占16.4%，醇類(lèi)占35.4%，烷烴類(lèi)占3.7%，酸類(lèi)占25.3%，酚類(lèi)物質(zhì)占19.2%。這23種揮發(fā)性組分中4-EG所占總峰比例最高，為14.2%。

3 結(jié)論

4-乙基愈創(chuàng)木酚是一種天然呈香化合物，對(duì)白酒香氣具有重要的貢獻(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)研究較少，國(guó)外報(bào)道較多。本研究從濃香型大曲中分離出1株具有較高4-EG產(chǎn)生能力的菌株，4-EG產(chǎn)量可達(dá)32.89 μg/g發(fā)酵產(chǎn)物，編號(hào)為EG06。通過(guò)對(duì)其菌落及菌體形態(tài)進(jìn)行觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens。

圖3 菌株EG06的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及分類(lèi)地位，Bootstrap檢測(cè)大于50%的被標(biāo)明在分枝上

圖4 菌株EG06發(fā)酵液揮發(fā)性組分的總離子色譜圖

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